El Grupo de Perth sostiene que nadie ha demostrado la existencia del virus VIH, y que el sida se debe a la oxidación.

martes, 1 de julio de 2014

El aislamiento del VIH, ¿se ha alcanzado realmente?



theperthgroup.com/CONTINUUM/PapadopolousReallyAchieved1996.pdf

theperthgroup.com/CONTINUUM/pgvsduesbergreward.html



Continuum
Vol.4 No.3 Sept./Oct. 1996


EL AISLAMIENTO DEL VIH -- ¿SE HA ALCANZADO REALMENTE?

Eleni Papadopulos-Eleopulos (1) Valendar F.Turner (2) John M. Papadimitriou (3) David Causer (1)

(1) Department of Medical Physics, (2) Department of Emergency Medicine, Royal Perth Hospital, Perth, Western Australia; (3) Department of Pathology, University of Western Australia.



"Listening to both sides of a story will convince you that there is more to a story than both sides" - Frank Tyger



La existencia definitiva de cualquier virus, incluyendo un retrovirus, se puede probar solamente mediante su aislamiento. Durante casi medio siglo los retrovirus han sido aislados mediante concentración en gradientes de densidad. Se acepta que los procedimientos incluidos en este método, que no es ni mucho menos perfecto, no se han seguido por los investigadores que afirman que el virus de la inmunodeficiencia humana, el VIH-1, ha sido aislado. Sin embargo, se dice que en la actualidad existen muchas pruebas de que el VIH se ha aislado y demostrado ser un retrovirus exógeno único (1). En esta crítica se han analizado los datos relevantes que pretenden probar que el VIH ha sido aislado. Para simplificar la presentación a los lectores de este artículo, los argumentos principales (1) del supuesto aislamiento del VIH se utilizan como encabezados en esta discusión. Como el tema es complejo y controvertido, se hace necesario presentar información original abundante, y a veces repetirla, para así evaluar críticamente la base de la opinión de que el VIH ha sido aislado.


1. "En 1983 Montagnier y sus colegas aislaron un retrovirus"

En el estudio de 1983 de Montagnier y sus colegas no hay ninguna prueba de aislamiento de virus por "el método más riguroso disponible hasta la fecha". Ni tampoco siguieron las "reglas tradicionales de Pasteur". ¿Cómo aislaron entonces un retrovirus? Incluso si Montagnier y sus colegas, u otros, hubiesen seguido las "reglas de Pasteur", puesto que "las proteínas celulares y virales, y los contaminantes celulares ... copurifican con el virus purificado mediante gradientes de densidad convencionales" (1), no hay motivo para aceptar ninguna reclamación de aislamiento del VIH por ningún grupo de investigación que no utilizase "el método más riguroso disponible hasta la fecha, es decir, la clonación molecular del ADN infeccioso del VIH. Sin embargo, para probar que el VIH "ha sido aislado" por "el método más riguroso disponible hasta la fecha", el clonado de virus, hay que comenzar con el ARN (ADN) del VIH. Puesto que el poder llamar a un ARN como "ARN del VIH" está supeditado al aislamiento previo de una partícula que este probada que sea un retrovirus, con solamente decir esto "el método más riguroso disponible hasta la fecha, es decir, la clonación molecular del ADN infeccioso del VIH", no puede probar el aislamiento del VIH.


2. "la transcriptasa inversa asociada con tales partículas"

No hay ni un solo estudio que demuestre que la enzima presente en el "medio de cultivo", o incluso en el material que, en gradientes de densidad de sacarosa, se concentra a 1,16 g/ml (la densidad que define las partículas retrovirales), y que cataliza la transcripción de ARN en ADN, sea un constituyente de partículas de ningún tipo, mucho menos de partículas con aspecto retroviral o de un retrovirus singular. La única asociación entre "partículas" y "transcriptasa inversa" (RT) surge a partir de experimentos que muestran que algunos cultivos-cocultivos con tejidos de pacientes con sida presentan partículas, muchas de las cuales ni siquiera tienen aspecto retroviral, y la transcripción del cebador-plantilla de ARN sintético A(n).dT15. Sin embargo, esto no constituye prueba de la existencia de la RT, o de la RT como constituyente de una partícula retroviral. Además, ya que:

(a) la presencia de transcriptasa inversa (RT) se prueba indirectamente, es decir, mediante la demostración de transcripción del cebador-plantilla de ARN A(n).dT15;
(b) el cebador-plantilla A(n).dT15 se puede transcribir no solamente mediante la RT, sino también mediante otras ADN polimerasas celulares;

entonces todas las ADN polimerasas celulares alfa, beta y gamma, pueden copiar el A(n).dT15 (2). De hecho, en 1975, una Conferencia Internacional sobre ADN polimerasas eucarióticas, y en donde Baltimore y Gallo estuvieron presentes (3), definió la polimerasa gamma como "un componente de las células normales" (4), "que ocurre de modo generalizado" (2), cuya actividad puede aumentarse por muchos factores, incluyendo la estimulación PHA (5), como la enzima que "copia el A(n).dT15 con una alta eficiencia, pero que no copia bien el ADN" (3); es imposible decir que la polimerasa en el "medio de cultivo" o en el material que se concentra a 1,16 g/ml, que cataliza la transcripción inversa del A(n).dT15 , es la RT o alguna de las demás ADN polimerasas celulares.


3. "ciertamente, cada uno de estos criterios podría reflejar otro retrovirus, y algunos de estos criterios, por ejemplo partículas y proteínas, podrían reflejar material completamente no viral.

Aunque los expertos del sida, incluyendo Montagnier, Gallo y Barré-Sinoussi afirman que la RT es "única para los retrovirus" y "el sello distintivo de un retrovirus" (6-8), esto no es así, un hecho aceptado por algunos de los más conocidos científicos (9). "La transcriptasa inversa (RT) fue descubierta por primera vez como un catalizador esencial en el ciclo biológico de los retrovirus. Sin embargo, en los últimos años, se han acumulado datos que muestran que las RT's están involucradas en un número sorprendentemente grande de eventos transcripcionales mediados por ARN, que incluye a entidades genéticas virales y no virales ... la posibilidad de que la retrotranscripción tuviera lugar en primer lugar a principios del Arcaico" se apoya con una serie de hechos y "la hipótesis de que el ARN precedió al ADN como material genético celular" (10). Según Varmus: "A la transcripción inversa se le asignó un papel central en la replicación de otros virus [virus de la hepatitis B y virus mosaico de la coliflor] y en la transposición y generación de otros tipos de ADN eucarióticos" (11). "Los virus de la hepatitis B (HBV's) son virus de ADN pequeños que producen infecciones hepáticas persistentes en diversos huéspedes animales, y replican sus genomas de ADN a través de la transcripción inversa de un ARN intermediario. Todos los miembros de esta familia contienen un marco de lectura abierto (ORF), "P" (de pol), que es homólogo a los genes pol retrovirales" (pol = polimerasa) (12). El virus de la hepatitis B (HBV) se asemeja a los retrovirus, incluyendo el VIH, en algunos aspectos. En particular, ambos virus contienen transcriptasa inversa, y se replican a través de un ARN intermediario". Debido a esto, se ha sugerido que la infección de la hepatitis B debería tratarse con los mismos agentes antiretrovirales que la infección de VIH (13). En la actualidad, existen datos que muestran que, aunque el órgano objetivo principal del virus de la hepatitis B es el hígado, otras células distintas a los hepatocitos "incluyendo los linfocitos y monocitos de sangre periférica, pueden llegar a infectarse con el HBV" (14). La estimulación de linfocitos en general y la estimulación PHA en particular está asociada con la producción de virus de hepatitis B a partir de linfocitos de sangre periférica en pacientes infectados con el HBV, incluyendo "la replicación viral en la infección de la hepatitis B crónica de la infancia" (15,16). Según Doolittle et al, "hay muchas entidades distintas a los retrovirus que llevan transcriptasa inversa, incluyendo los elementos móviles encontrados en una amplia variedad de eucariontes, algunos virus de ADN de plantas y animales, e incluso algunos intrones" (17). En una de sus publicaciones más recientes, uno de los retrovirólogos mejor conocidos, Robin Weiss, del Institute del Cancer Research, Londres, Gran Bretaña, escribió: "Ahora sabemos que un grupo de elementos genéticos más amplio que los retrovirus utilizan la transcripción inversa en alguna etapa de replicación; entre éstos están los hepadnavirus (incluyendo el virus de la hepatitis B), el virus de mosaico de la coliflor, y retrotransposones de eucariotas y procariotas. De hecho, la lamivudina podría tener su labor en el tratamiento de las infecciones de hepatitis B, así como las del VIH" (18). Es decir, la RT no parece ser más específica a los retrovirus que la ATPasa, una enzima que ahora se sabe que es omnipresente, pero que, antes del descubrimiento de la RT, era utilizada para detectar y para cuantificar retrovirus (19). Dado que en toda la literatura del VIH, por aislamiento del VIH solamente se quiere decir la detección de "partículas de VIH", proteínas y RT (y con frecuencia solamente una de ellas), y puesto que cualquiera o todos estos fenómenos "podrían reflejar material completamente no viral", ¿no se sigue que el VIH podría reflejar material completamente no viral?.


4. "antígenos o proteínas del VIH asociadas con tales partículas"

Hasta la fecha nadie ha presentado pruebas de que los "antígenos o proteínas del VIH"sean constituyentes de una partícula retroviral, o incluso de una partícula con aspecto retroviral, mucho menos de un retrovirus singular VIH.


5. "anticuerpos contra la cepa de VIH de Montagnier, el estándar global de todos los tests del VIH"

5.1 En el artículo de 1983 titulado "Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS)" (20) , Montagnier y sus colegas informaron del "aislamiento" de su cepa de "VIH"; las células obtenidas a partir de una biopsia de ganglio linfático de un hombre homosexual con linfadenopatía (síndrome de linfadenopatía [LAS]) se pusieron en cultivo con PHA, IL-2 y antisuero de interferón humano. (Este último se había mostrado previamente que llevaba en ratones a una "producción de retrovirus incrementada por un factor de 10 a 50"). Después de 15 días, se detectó actividad RT utilizando el cebador-plantilla sintético A(n).dT15. La transcripción inversa del A(n).dT15 se consideró como prueba de que un retrovirus estaba presente en las células de los ganglios linfáticos. El hallazgo de la misma actividad en el sobrenadante de un cocultivo de las mismas células con linfocitos de un individuo sano se consideró como prueba de que el retrovirus podía transmitirse. En otro experimento, el polibreno y el sobrenadante de los cocultivos se añadieron a dos cultivos de linfocitos de cordon umbilical, de tres días de antigüedad. Tras siete días se detecto "una relativamente alta concentración" de transcripción de A(n).dT15 . A esto se lo consideró como prueba no solamente de transmisión, sino también de aislamiento. "El que éste nuevo aislamiento era un retrovirus, fue apoyado adicionalmente por su densidad en un gradiente de densidad de sacarosa, que fue de 1,16 , y por su etiquetado con uridina [3H] (fig. 1)" En la figura 1 se presentaron datos de que la A(n)dT12- 18 podía transcribirse por el material del sobrenadante de los cultivos de células umbilicales que, en gradientes de densidad de sacarosa, se concentraban a 1,16 g/ml. Los linfocitos de cordon umbilical "infectados", así como las células "produciendo HTLV" fueron lisados. A las proteínas procedentes de un "fragmento celular" obtenido de los lisados se las hizo reaccionar con el suero del paciente con linfadenopatía, de otro paciente con "múltiples adenopatías", de un individuo sano, de una cabra normal, y con antisuero de cabra "a la p24 del HTLV-I". Muchas proteínas de ambos tipos de células, pero especialmente las de los cordones umbilicales "infectados", reaccionaron con TODOS los sueros. Sin embargo, las células de cordón umbilical "infectado" no reaccionaron con el antisuero a la "p24 del HTLV-I". A las proteínas del sobrenadante del cultivo que se concentraron a 1,16 g/ml también se las hizo reaccionar con los sueros, pero en vez del antisuero anti-p25 de cabra utilizaron sueros de otro donante sano. En las tiras publicadas es difícil, si no imposible, distinguir alguna banda reactiva con algún suero. En el texto se afirma que "se pueden ver tres proteínas principales: la proteína p25 y proteínas con pesos moleculares de 80.000 y 45.000" en la tira con el suero del paciente con LAS. Montagnier et al también reportaron que la "microscopía electrónica de los linfocitos de cordón umbilical infectados mostró partículas inmaduras típicas con media luna densa (tipo C) gemando de la membrana plasmática". No facilitaron datos de microscopía electrónica (ME) del material concentrado a 1,16 g/ml, pero concluyeron: Un retrovirus perteneciente a la familia de los virus de leucemia de células T humanas (HTLV) recientemente descubiertos, pero claramente distinto de cada aislamiento previo, se ha aislado a partir de un paciente caucásico con signos y síntomas que con frecuencia preceden al síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida). El virus es un virus de tumor de ARN tipo C típico, gema de la membrana de la célula, prefiere el magnesio para la actividad de transcriptasa inversa, y tiene un antígeno interno (p25) similar a la p24 del HTLV" (20). (Cuando se advirtió de que los individuos que tienen anticuerpos que reaccionan con esta "cepa de virus" no progresan rápidamente a sida, sin ninguna prueba, el retrovirus "tipo C típico" se conviertió en otro taxonómicamente distinto, el Lentivirus típico).

5.2 LA PALABRA "AISLAMIENTO" PROVIENE DE LA PALABRA "INSULATUS" DEL LATIN, Y SIGNIFICA "HECHO A UNA ISLA". SE REFIERE AL ACTO DE SEPARAR UN OBJETO DE TODA LA MATERIA EXTRAÑA QUE NO ES ESE OBJETO. El objeto de interés no es una proteína, ni un fragmento de ARN (ADN), sino un retrovirus exógeno singular, el VIH, nada más y nada menos. Montagnier et al no presentaron tal prueba. Obviamente, en el mejor de los casos, el hallazgo de fenómenos tales como partículas con aspecto viral en cultivos celulares, reacciones anticuerpo-antígeno, y datos acerca de la transcripción inversa de A(n).dT15, se puede considerar como prueba de la detección de un retrovirus sí y solamente sí se demuestra que cada uno es específico al retrovirus. Esto no se puede hacer a menos que el retrovirus sea primero aislado. De este modo, no es ninguna sorpresa que Popovic, Gallo y sus colegas no considerasen los datos de Montagnier et al como prueba de "verdadero aislamiento" (21). [En sus artículos de 1984 Gallo y sus colegas definieron el aislamiento como la detección de "más de uno de lo siguiente": "detección repetida de actividad de transcriptasa inversa dependiente de Mg2+ en fluidos de sobrenadante; virus observados mediante microscopía electrónica (ME); expresión intracelular de antígenos relacionados con el virus detectados con anticuerpos de donantes seropositivos, o con antisuero de conejo al HTLV-III; o transmisión de partículas" (mediante transmisión de partículas se quiso decir detección de RT o partículas en cultivos de sangre de cordón umbilical humano, en médula ósea o en linfocitos T de sangre periférica, cultivados con sobrenadantes procedentes de los cultivos "infectados"). Dado que esto no es distinto de los experimentos realizados por Montagnier y sus colegas, se deduce que Gallo y sus colegas no demostraron un "verdadero aislamiento" tampoco. De hecho, de la definición de aislamiento de Gallo et al surgen preguntas adicionales, incluyendo: ¿cómo fue posible obtener antisuero de conejo al "HTLV-III" antes de que el virus fuese aislado? y ¿cómo fue posible determinar que tanto el antisuero de conejo como el suero del paciente, utilizados para testear material de los cultivos, interactuaban específicamente con el virus antes de que el virus fuese aislado? Según su definición, se puede aislar el VIH incluso si no se detecta RT. ¿Cómo es esto posible si el RT es el "sello" del VIH? (22). Es también significativo que en la solicitud de patente de él y sus colegas de 1986, "Mejoras relacionadas con aislamientos virales y su uso", Robin Weiss se refirió a la "cepa del VIH" de Montagnier como "el material". El llamado aislamiento del virus del sida fue reportado por primera vez en 1983, por Montagnier y sus colegas en Francia, quienes lo llamaron "Virus Uno Asociado a la Linfadenopatía" (23). Por otra parte, el aislamiento de un retrovirus a partir de los cultivos de cordón umbilical no es prueba de que el retrovirus se introdujese desde el exterior, es decir, que se originase del paciente con linfadenopatía. Todas las células contienen retrovirus endógenos (ver 6.3.2). De hecho el esperma, los óvulos, la placenta, los tejidos fetales y embrionarios, y en menor medida los linfocitos de cordón umbilical, se estudiaron ampliamente, ya que se dijo que los retrovirus eran transmitidos verticalmente (en la línea de células germinales), y debido a que se pensó que desempeñaban un papel significativo en la diferenciación. A principios de la era del sida, se reportó uno o más de los siguientes fenómenos a partir de experimentos con tales células: partículas con aspecto retroviral, actividad de transcriptasa inversa, y antígenos retrovirales (24-26). Por lo tanto, estos hallazgos no pueden ser prueba de la existencia del VIH.

La presencia de anticuerpos en los pacientes de sida, pero no en controles sanos, que reaccionan con las proteínas que se concentran a 1,16 g/ml, tampoco es prueba de que tales individuos estén infectados con un retrovirus exógeno, el VIH. Por ejemplo, en un estudio publicado este año, uno de los más conocidos retrovirólogos, Reinhard Kurth, del Instituto Paul-Ehrlich de Alemania, y sus colegas, reportaron que el 70% de los "pacientes positivos al VIH", comparado con solamente un 3% de donantes de sangre, tenían anticuerpos que reaccionaban con el retrovirus HTDV/HERV- K. Sin embargo, el HTDV/HERV- K no es un retrovirus que esté presente solamente en pacientes de sida, es decir, un retrovirus exógeno como se dice que es el VIH, sino que el HTDV/HERV- K es un retrovirus endógeno, o como Kurth dice, un retrovirus presente "en todos nosotros". ¿Cómo es posible entonces decir, basandose simplemente en un test de anticuerpos, que la "cepa de Montagnier", si se da por bueno que Montagnier aisló tal virus , no es otro retrovirus endógeno generado por las condiciones presentes en estos pacientes? (ver 6.3.2).

5.3 Al parecer, el grupo de Montagnier encontró reacciones entre el suero de los pacientes y tres proteínas: p25 (p24), p45 (p41) y p80, en el material concentrado a 1,16 g/ml, pero solamente se consideró a la p24 como proteína del VIH. Sin embargo, en 1984, el grupo de Gallo informó de que "ningún antígeno de los clones no infectados reaccionaron con el suero, con la excepción de una proteína con un peso molecular de 80.000 en H17, que vinculó a anticuerpos de todas las muestras de suero humano ensayadas [incluyendo suero normal], pero no de suero de conejo o de cabra". Debido a esto se consideró a la proteína p80 como no específica. "Los antígenos expresados nuevamente [reactivos con sueros en los fragmentos celulares] tras la infección viral y reconocidos por el suero humano utilizado para este análisis incluyeron la p65, p55, p41, p39, p32, y p24. También se detect una gran proteína con un peso molecular de aproximadamente 130.000, y una proteína de 48.000". A diferencia de Montagnier, el grupo de Gallo también reportó que "con suero humano normal, no se detecto ninguno de los antígenos (no mostrado)", llegando a la conclusión de que "estos resultados muestran claramente que los antígenos detectados tras la infección con el virus son proteínas codificadas por el virus o bien antígenos celulares inducidos específicamente por la infección" (27). Gallo y sus colegas también reportaron que de las proteínas del sobrenadante de los cultivos "infectados" que en gradientes de densidad de sacarosa se concentraron a 1,16 g/ml, solamente dos proteínas, la p41 y la p24, reaccionaron con los sueros de pacientes, concluyendo que "estas moléculas son los principales componentes de la preparación de virus; por tanto la p24 y la p41 pueden considerarse las proteínas estructurales virales". En los dos años siguientes a su descubrimiento del VIH, y aunque al parecer hicieron repetidos intentos, el grupo de Montagnier, a diferencia del grupo de Gallo, no pudo detectar una proteína de "alto peso molecular" que reaccionaba con distintos sueros, pero que "no estaba presente en el sobrenadante de células de control no infectadas". En experimentos reportados en 1985, en vez de utilizar linfocitos de cordón umbilical usaron células H9 y CEM "infectadas", dos líneas de células leucémicas cultivadas (etiquetadas) con cisteína radioactiva, 35S cisteína (un aminoácido esencial constitutivo de las proteínas humanas). Reportaron que en el sobrenadante "una proteína de aproximadamente 110-120K podía inmunoprecipitarse específicamente por los sueros de los pacientes de pre-sida o sida, además de las proteínas del núcleo, y no por los sueros de donantes de sangre sanos normales o de trabajadores de laboratorio. La proteína estaba ausente en sobrenadantes de linfocitos T no infectados, líneas de células T o B". También mostraron que la proteína 110K era una glicoproteína (gp110). Por razones no establecidas, pensaron que la proteína 110K tenía un precursor celular. Para demostrarlo, en vez de utilizar las líneas de células CEM o H9, formaron "un híbrido celular entre los linfocitos T4 normales y la línea de células MOLT-4, que fue entonces "infectada" con el LAV y cultivada con cisteína radioactiva. Los sincitios resultantes fueron lisados, y a las proteínas se las hizo reaccionar "con suero positivo al LAV". "Después de 3 horas de etiquetado, se detectó una banda de 150K, y tras un etiquetado más largo (12 horas) apareció otra banda de 135K". Curiosamente, esto se interpretó como que "se sugería que [la 135] se derivaba del precursor 150K", y que "bien en el citoplasma o en la membrana celular, la gp150 se convierte en la forma gp135 ... Durante la morfogénesis del virus, la gp135 se convierte en gp110-120 mediante eliminación enzimática parcial de carbohidratos, sin escisión proteolítica. La gp110 asociada al virus [ni una sola pieza de sus datos se deriva ni siquiera de una partícula de aspecto viral o material concentrado a 1,16 g/ml. Todo fue de células "infectadas" o sobrenadante de cultivo] puede por sí misma ser procesada de modo adicional durante el envejecimiento del virus ... además de la banda principal 110-120K vista tras el etiquetado del virus, otras tres bandas delgadas de 70K, 40K y 34K respectivamente se podían inmunoprecipitar especialmente, mediante los sueros de los pacientes. Puesto que algunos de estos sueros no precipitaron ninguna proteína gag, se puede suponer que estas proteínas están relacionadas antigénicamente con la gp110 y son productos de escisión de esta última" (28). Se puede cuestionar esta conclusión en varios aspectos, baste mencionar solamente dos:
(a) El sobrenadante del cultivo y las células no pueden considerarse como sinónimo de un retrovirus.
(b) Aunque Montagnier et al no lo comentaron, sus datos muestran que muchas proteínas, incluyendo una p40 encontrada en el sobrenadante de células CEM y H9 "no infectadas", reaccionan con sueros de los pacientes con linfadenopatía. De alguna manera, sin tener pruebas de que estuviesen codificadas por "ADN del VIH", o que perteneciesen a una partícula de aspecto retroviral, a las siguientes proteínas: gp160/150, gp120, gp45/40, p34/32, p24, p18/17, encontradas en células, en sobrenadantes o concentrándose a 1,16 g/ml en gradientes de densidad de sacarosa, se las conoció como las proteínas del VIH. Dicho en otras palabras, de modo contrario a todo razonamiento científico, se postuló que los sueros de sida contenían anticuerpos al VIH específicos, y a las proteínas con la que estos anticuerpos reaccionaban se la definió como proteínas específicas del VIH.


5.4 Las "glicoproteínas del VIH": gp160, gp120 y gp41

(a) En 1983 (20), y de nuevo en 1984, Montagnier y sus colegas (29) sostuvieron que aunque la p45/41 reaccionó con los sueros de los pacientes, esta proteína no era viral, sino la omnipresente proteína celular actina. Es interesante que, incluso ese año, los criterios utilizados por Montagnier para definir un Western blot VIH positivo fueron: "la presencia de anticuerpos frente a productos del gen env (gp160, gp120), y reactividad con al menos un producto del gen gag (criterios de la OMS)" (30). Sin embargo, hasta la fecha, ningún otro criterio, ni siquiera los criterios de la OMS, excluyen a la p41. Los criterios de la OMS son: "2 bandas env (precursor, gp externa o gp transmembrana), con o sin otras bandas" (transmembrana = gp41) (31). A diferencia de Montagnier, Gallo considera la p41 como la proteína del VIH más específica.

En 1985 Gallo y sus colegas, comparando el cuarto marco abierto de lectura (ORF) del "ADN del VIH", al que llamaron env-lor, con los genes env de otros retrovirus, reportaron que: "El producto previsto del cuarto marco de lectura env-lor comparte muchas características en común con los precursores de gen de envoltura de otros retrovirus, la más notable de las cuales es una región hidrófoba cerca de la mitad de la proteína ... El dominio amino terminal del producto de traducción del cuarto marco abierto de lectura también se asemeja a los precursores de proteína env de otros retrovirus ... creemos que el cuarto marco abierto de lectura codifica un precursor de env ... En su forma madura es probablemente escindido en una gran proteína de membrana exterior fuertemente glicosilada de unos 481 aminoácidos de longitud, y una proteína transmembrana de 345 aminoácidos de largo que podría estar glicosolada. El tamaño de estos productos predichos concuerda con la detección de una gran proteína glicosilada de Mr 120-160K en células infectadas con el HTLV-III, que es probablemente el precursor de gen env glicosilado, y una más pequeña gp41 asociada a virión, que es probablemente la proteína de membrana" (32). Sin embargo, en un estudio publicado en 1987 por Gallo y sus colegas, en donde realizaron un "análisis asistido por ordenador" de "las secuencias de aminoácidos de los complejos de proteína de la envoltura derivados de las secuencias de nucleótidos de siete aislamientos del virus del sida", se reportó que "Aunque los tamaños totales y estructuras de las siete proteínas de superficie son bastante similares, las secuencias de aminoácidos deducidas difieren sustancialmente. En promedio, solamente el 66% de los aminoácidos se conservan en la parte exterior de la proteína ... gp41, la parte de transmembrana del complejo de la proteína de la envoltura muestra más de un 80% de aminoácidos conservados", pero "la gp41 debería ser de aproximadamente 52.000 a 54.000 daltons por cálculo" (33). Incluso si el peso molecular de la glicoproteína, predicha a partir de la longitud del cuarto ORF del "VIH", se encontrase que fuese igual al de la proteína presente en el Western blot (41.000), la afirmación de Gallo de que la interacción de la gp41 con los anticuerpos encontrados en sueros de pacientes de sida prueba que la gp41 está codificada por el "genoma del VIH", y que tanto la gp41 como los anticuerpos son específicos a un retrovirus, está en contradicción con lo que Gallo decía en 1981. A mediados de los años 70, Gallo y sus colegas reportaron el aislamiento del primer retrovirus humano, el HLV23. De hecho, las pruebas del "aislamiento" del HLV23 superaron a las del HTLV-I y el VIH en al menos dos aspectos. A diferencia del VIH, el grupo de Gallo:

(a) informó de la detección de transcriptasa inversa en leucocitos frescos, no cultivados (34);
(b) publicó una micrografía electrónica de partículas de aspecto viral concentrándose a densidad de sacarosa de 1,16 g/ml (35).

Tras el descubrimiento del HLV23, algunos investigadores intentaron determinar su prevalencia utilizando tests de anticuerpos (36), mientras que otros estaban interesados en determinar la especificidad de las reacciones de anticuerpos. Entre los primeros estaban dos de los expertos del VIH más conocidos, Reinhard Kurth y Robin Weiss, y sus colegas, quienes utilizaron para este propósito "el virus ayudante asociado a sarcoma de simios (SSAV) y la cepa M7 del virus endógeno babuino (BEV) para examinar los sueros humanos en búsqueda de anticuerpos específicos. También se incluyó un virus (HL23V-1) aislado originalmente a partir de leucocitos de sangre periférica cultivados procedentes de un paciente con leucemia mielógena aguda. Se vio que el HL23V-1 comprendía una mezcla de dos virus, uno estrechamente relacionado con el SSAV, el otro con el BEV", y encontraron que "Un estudio de los sueros humanos de individuos sanos reveló la presencia de anticuerpos que ocurren de un modo natural y que reaccionan en ensayos de radioinmunoprecipitación con proteínas de los virus tipo C de mamífero", incluyendo las proteínas interna (gag) y cubierta (env) del HL23V, SSAV y BEV, concluyendo que "Los estudios serológicos presentados aquí y por otros proporcionan datos indirectos de que el modo de transmisión infeccioso sigue siendo una posibilidad real en los seres humanos, y sugiere que la infección con un oncornavirus [retrovirus] podría estar extremadamente extendida" (37). Tres años más tarde, en 1980, dos grupos de investigación (38,39), uno del Laboratory of Cellular and Molecular Biology, National Cancer Institute, el otro del Laboratory of Viral Oncology, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, utilizando las "glicoproteínas virales", encontraron que los anticuerpos presentes en los sueros humanos que reaccionaban con estas proteínas estaban "dirigidos contra estructuras de carbohidratos" y concluyeron que "Los resultados son consistentes con la idea de que los anticuerpos en cuestión se obtienen como resultado de la exposición a muchas sustancias naturales que poseen muchos antígenos de reacción cruzada, y no son el resultado de una infección generalizada del hombre con oncovirus competentes de replicación". En 1981 Gallo aceptó las pruebas de que los anticuerpos que reaccionaban con las proteínas del HL23V no estaban dirigidos contra las proteínas, "sino contra las partes de carbohidrato en la molécula que se introducen por la célula huesped como un evento post-transcripcional, y que por tanto son específicos de célula, y no específico de virus" (40). Este descubrimiento fue de tal importancia que hoy en día, ni siquiera Gallo, considera al HL23V como el primer retrovirus humano, ni siquiera un retrovirus. De hecho, en 1981, cuando Gallo y sus colegas informaron de la presencia en humanos de anticuerpos a lo que ahora él llama el primer retrovirus humano, el HTLV-I (según Weiss, "El primer retrovirus 'humano', aislado en 1971, fue el virus espumoso humano (HFV), a partir de una línea de carcinoma nasofaríngea" (18)), el título del artículo fue: "Anticuerpos en sueros humanos reactivos contra una proteína estructural interna del virus de linfoma de células T humanas" (40). En este artículo, Gallo y sus colegas describieron el hallazgo de anticuerpos a una "proteína estructural interna principal (p24) de HTLVCR" y sostuvieron que tales anticuerpos estaban "dirigidos específicamente a las proteínas HTLVCR, y no a determinantes específicos de célula. Es decir, las reacciones inmunológicas no son aquellas reportadas en sueros humanos contra glicoproteínas de virus animales, las cuales, a falta de especificidad del virus, están dirigidas contra los residuos de carbohidratos de la glicoproteína".

(b) En 1989, investigadores de Nueva York mostraron que en los análisis de Western blot, "los componentes visualizados en la región 120-60 kDa no se corresponden a la gp120 ni a su precursor, sino que representan oligómeros de la gp41". También se mostró que el patrón WB obtenido depende de muchos factores, incluyendo la temperatura y la concentración de sulfato de dodecil de sodio utilizado para alterar el "virus puro". "La confusión sobre la identificación de estas bandas ha dado lugar a conclusiones incorrectas en estudios experimentales. De modo similar, algunos espécimenes pueden haber sido identificados erróneamente como seropositivos, en el supuesto de que estas bandas reflejasen reactividad específica frente dos componentes virales distintos, y cumplido un criterio para la positividad verdadera o probable. La identificación correcta de estas bandas afectará a las normas que se establezcan para la positividad del Western blot: podría requerir la reinterpretación de los resultados publicados" (41,42) (poco caso, si alguno, se hizo a este informe). Ciertamente si, como se afirma, los Western blots del VIH se preparan a partir de lisados de viriones de VIH purificados, entonces sería imposible encontrar la p160 y la p120 en las tiras del WB, ya que: (i) Todos los investigadores del VIH están de acuerdo con Montagnier y Gallo en que la gp160 es una precursora de la gp120 y la gp41, y a diferencia de estas dos últimas, se encuentra solamente en células infectadas y no en partículas maduras; (ii) Aunque se han publicado muchas ME de partículas con aspecto viral en material sin concentrar a 1,16 g/ml, nadie (43,44), ni siquiera el CDC (45), ni Hans Gelderblom y sus colegas, quienes han estudiado más a fondo estas partículas, han probado la existencia en los cultivos de partículas libres de células con protuberancias (botones). En una de sus últimas publicaciones, Gelderblom y sus colegas han calculado que , inmediatamente después de ser liberadas, las "partículas de VIH" tienen un promedio de 0,5 botones por partícula, pero también señalaron que "era posible que pudieran observarse estructuras parecidas a botones incluso cuando no estuviese presente la gp120, es decir, falsos positivos" (46). Se acepta que la gp120 está presente solamente en los botones (protuberancias). Puesto que no hay pruebas de la presencia de botones en las partículas libres de célulad, incluso inmediatamente después de liberarse de la célula, no es posible que la gp120 esté presente en el Western blot.


5.5 La "proteína pol del VIH", p31/p34"

En 1987 Henderson aisló la p30-32 y la p34-36 del "VIH purificado mediante doble banda" en gradientes de densidad de sacarosa. Mediante la comparación de las secuencias de aminoácidos de estas proteínas con las proteínas de histocompatibilidad DR de Clase II, llegaron a la conclusión de que "las cadenas alfa y beta DR parecían ser idénticas a las proteínas p34-36 y p30-32 respectivamente" (47);


5.6 La "proteína gag del VIH", p24

Por lo que a Montagnier se refiere, la p24 es la proteína más importante del VIH, y durante al menos 3 años después de la introducción del test de anticuerpos del "VIH", el hallar una banda p24 en el WB se consideró por la mayoría de laboratorios, incluyendo el CDC, como prueba de la infección por VIH. En la actualidad existen muchos datos de que los anticuerpos que reaccionan con la p24 son omnipresentes tanto en suero humano como animal, lo que solamente puede interpretarse como que la p24, los anticuerpos, o ambos, no son específicos al VIH, o bien que una proporción importante de hombres y animales están infectados con el VIH. Por ejemplo, si la banda p24 del WB se considera como prueba de la infección por VIH entonces alrededor del 30% de los individuos que son transfundidos con sangre negativa al VIH se convertirían en positivos como resultado (48). Dado que, de acuerdo con el AID vaccine Clinical Trials Group (49), "La presencia de la banda p24 fue común entre los voluntarios no infectados de bajo riesgo y complicó la interpretación de los resultados del test Western blot", la infección por VIH debería ser común entre los individuos sanos sin riesgo. De hecho, a causa de estos datos, desde 1987, con quizá dos únicas excepciones: Montagnier y los investigadores que llevan a cabo el Multicenter AIDS Cohort Study, en los Estados Unidos, ningún laboratorio en ninguna parte del mundo considera una reacción entre la p24 en el WB y los anticuerpos presentes en los sueros como prueba de infección por VIH. Sin embargo, cuando la misma reacción tiene lugar entre un anticuerpo a la p24 del WB y un suero de paciente, se considera como prueba de viremia, y cuando ocurre entre un anticuerpo a la p24 y el material presente en un cultivo celular, la misma reacción se considera como prueba de aislamiento del VIH.

Obviamente, la detección de una proteína, incluso si se sabe que es específica de virus, en sueros o incluso en cultivo, no constituye una prueba de aislamiento o viremia. Que tal hallazgo no es específico se ilustra mejor con algunos ejemplos. En 1992, Jorg Shupbach, el autor principal de uno de los cuatro primeros artículos de 1984 publicados por el grupo de Gallo sobre el aislamiento del VIH, reportó que los cultivos de sangre completos de 49 de 60 (82%) de "individuos presumiblemente no infectados pero serológicamente indeterminados, y de 5 de 5 donantes de sangre seronegativos, fueron positivos a la p24" (50). Si la p24 es una proteína del VIH, entonces debería estar presente en todos los pacientes de sida, si no en todos los pacientes seropositivos, y no en personas que no están en riesgo de desarrollar sida. En 1989, David Ho y sus colegas utilizaron mediciones de p24 en suero y en cultivos de células no infectadas cultivadas con plasma de pacientes "infectados", para estimar virus activo, "VIH-1 infeccioso", viremia y carga viral. El suero de 14 de 53 pacientes, cuyos cultivos de plasma fueron positivo, fue negativo para la p24. Concluyeron que "De este modo, en la detección de la presencia de VIH-1 libre de células en sangre, el cultivo de plasma fue más sensible que la medición del antígeno p24 en suero". También reportaron que el tratamiento con AZT durante cuatro semanas indujo "una reducción del 94 por ciento en la carga de virus libre de células" (51). Incluso Jackson et al, quienes afirman que una tasa total de "aislamiento del VIH" del 98,3%, puede detectar la p24 en el suero del 42% de los pacientes de sida, el 37% de los pacientes con ARC y el 17% de individuos seropositivos asintomáticos (52), que es una tasa mucho más baja que en los receptores de transplantes de órganos no infectados con el VIH. "En un receptor de riñón (el donante fue negativo al antígeno p24), quien 3 días después del transplante presentó fiebre, debilidad, mialgias, tos y diarrea, todas las muestras bacteriológicas, parasitológicas y virológicas fueron negativas [incluyendo la PCR del VIH]. El único resultado positivo fue el de antigenemia p24, positiva con kits de antígenos de Abbot en muy altos títulos de 1000 pg/ml para ensayos policlonales y de 41 pg/ml para ensayos monoclonales. Esta antigenemia fue totalmente neutralizable con antisuero de Abbot anti-p24 ... 2 meses después del transplante, todos los ensayos para el antígeno p24 se volvieron negativos, sin aparición de anticuerpos contra el VIH. Cinco meses después del transplante nuestro paciente permanece asintomático, la función renal es excelente, la antigenemia p24 sigue siendo negativa, y los anticuerpos del VIH siguen siendo negativos" (53). Utilizando dos kits, el Abbot y el Diagnostic Pasteur, en un estudio se detectó la p24 de forma transitoria en 12 de 14 receptores de riñón. Los títulos máximos oscilaron entre 850 a 200.000 pg/ml de 7 a 27 días post-transplante. Dos receptores de corazón y 5 de 7 receptores de médula ósea fueron también positivos, aunque los títulos fueron más bajos y variaron desde 140 a 750 pg/ml. La desaparición de la p24 llevo más tiempo en los receptores de riñón (6 meses aproximadamente) que en los de médula ósea (de 4 a 6 semanas aproximadamente). Según los autores: "Esto puede estar relacionado con las diferencias en la terapia inmunosupresora". Al discutir sus resultados escribieron: "La observación de una proteína de 25-30 kD uniéndose a sueros humanos anti-VIH policlonales después de inmunoblots con sueros reactivos plantea varias preguntas. Esta proteína podría estar relacionada con una respuesta inmune del huésped a los injertos o transplantes ... Su detección temprana después del transplante podría indicar las implicaciones de la terapia de inmunosupresión ... La proteína 25-30 kD podría por tanto compararse con el antígeno p28 recientemente descrito con la secuencia endógena linfotrópica de virus relacionado con células T humanas ... La caracterización de esta proteína 25-30 kD podría representar una importante contribución a la detección de retrovirus endógenos relacionados con el VIH-1" (54). El desacuerdo entre Montagnier y Gallo sobre qué proteínas eran en realidad las proteínas del "VIH" no se limitó a la gp41, sino también a la p24. Montagnier siempre mencionó que "no existía reactividad cruzada entre la p24 del VIH y otros anticuerpos, incluyendo anticuerpos al HTLV-I, II". Hasta 1985, también sostuvo que había "una muy estrecha homología entre el LAV y el HTLV-III, pero una ausencia de homología con el HTLV-I y II" (28). Sin embargo, en 1985 escribió: "También hemos comparado las secuencias de aminioácidos deducidas de las proteínas LAV con las del HTLV-I y otros retrovirus, no encontrándose ninguna homología significativa, excepto para los dominios pol y gag, que se conservan generalmente entre los retrovirus" (55).

Gallo siempre mantuvo que existe una homología entre los genes gag del HTLV-I, II y VIH (56), y que las muchas características compartidas por todos los "retrovirus humanos" incluyen "una pequeña proteína principal de la cápside (p24/p25); determinante antigénico de reacción cruzada p24, detectado con antisueros heterólogos (conejo) o bien con anticuerpos monoclonales humanos" (57). Ciertamente, gag significa antígenos específicos de grupo. Ya en 1974 Gelderblom y sus colegas escribieron: "Mientras que los antígenos de la envoltura del virus son principalmente específicos a la cepa de virus, la mayor parte de las proteínas internas del virión con un peso molecular (mw) entre 10.000 d y 30.000 d son específicas de grupo (gs) para virus que se originan en unas especies animales dadas (antígenos gs-spec.). La proteína principal constituyente de oncornavirus de tipo C [retrovirus] de mamíferos, con un peso molecular en el rango de los 30.000 d, se encontró que poseía, además de un antígeno gs spec, un determinante antigénico que es compartido por los virus de tipo C de muchas especies de mamíferos, incluyendo monos, y por lo tanto se las llamó antígeno de gs interespecies (gs-interspec.)." (58). En 1989 William Blattner, un experto del VIH-sida bien conocido, afirmó que "podría ser factible utilizar sondas de antígenos virales para buscar anticuerpos de reacción cruzada, ya que ciertas proteínas virales, en particular las proteínas polimerasa y gag, podrían estar altamente conservadas entre subtipos de virus" (59). Por lo tanto, incluso si la p24 fuese específica a los retrovirus, no puede ser específica al VIH. Si la p24 detectada en sobrenadantes de cultivo es un componente de partículas similares, virales y no virales, entonces todas las p24 deberían encontrarse en gradientes de densidad en al menos en una banda (fracción), incluso si no fuese a una densidad de 1,16 g/ml. Que este no es el caso ha sido demostrado por el propio Montagnier. En un experimento, Montagnier y sus colegas dividieron el gradiente de densidad en 16 fracciones. El pico de RT se encontró en las fracciones cinco y sexta, mientras que la p24 y la gp110 estuvieron presentes en todas las fracciones menos en tres (1,2,3). (28)


5.7 El rol de la actina y la miosina en partículas gemando

No hay ningun razón científica para definir una proteína presente en una célula, el sobrenadante de cultivo, o incluso en el material concentrado a 1,16 g/ml en gradientes de densidad de sacarosa, como siendo retroviral sobre la base de que reacciona con anticuerpos en sueros de pacientes de sida, como hicieron los grupos de Montagnier y Gallo. Según Gelderblom, los sueros de pacientes de sida son "poliespecíficos" (60, 61), y en la actualidad hay muchos datos de que estos sueros reaccionan con una gran cantidad de antígenos propios y no propios, incluyendo proteínas de linfocitos "no infectados". ¿Por qué entonces no deberían también reaccionar con las "proteínas del VIH", incluso si tales proteínas son proteínas celulares, o con una variedad de antígenos recombinantes o sintéticos? Si las proteínas en los cultivos-cocultivos de tejidos derivados de pacientes de sida y que reaccionan con los sueros de pacientes de sida son en verdad retrovirales, entonces ¿qué son las proteínas en las células y sobrenadantes "no infectados" que Montagnier reportó repetidamente como que también reaccionaban con los sueros de pacientes de sida? Sobre la base de la reactividad con los sueros de pacientes de sida, solamente el 20% de las proteínas que se concentran a 1,16 g/ml se pueden considerar como "proteínas del VIH" y, como los expertos VIH-sida afirman, sin pruebas, están cofdificadas mediante el "ADN del VIH" (47, 62). Incluso si hubiese pruebas de que las partículas de "VIH" puras (aisladas) estuviesen presentes a 1,16 g/ml, entonces todas las proteínas que se concentran a 1,16 g/ml deberían estar incorporadas a tales partículas. Sin embargo, puesto que solamente el 20% de estas proteínas son proteínas del "VIH", entonces surge la pregunta: ¿cuál es el origen y la función del 80% restante de las proteínas en tales partículas, y mediante qué genes están codificadas? ¿Por qué solamente el 20% de las proteínas son virales, no celulares? ¿Por qué no todas ellas, o viceversa? Si la proteína gp41 presente en la banda del Western blot y que reacciona con los sueros de pacientes de sida podría ser la proteína ubicua actina, entonces se debería considerar a la proteína p24 como una de las cadenas ligeras de la miosina, otra proteína igualmente ubicua, especialmetne dado que:
(a) Matsiota, Montagnier y sus colegas del Instituto Pasteur han demostrado que los pacientes de sida y aquellos en situación de riesgo tienen altos niveles de anticuerpos a esta proteína (63);
(b) en la actualidad hay muchos datos acerca de que una gran cantidad de proteínas celulares (microglobulina b2, las cadenas a y b del antígeno de linfocito humano (HLA) DR, CD71, CD63, CD43, CD8, los principales receptores de adhesión de leucocitos LFA-1 (CD11A/CD18) y CD44), que están presentes en las "partículas de VIH" incluyen la actina y la miosina (64-68).
Ciertamente, en los últimos años algunos investigadores de varias instituciones expresaron la opinión de que la polimerización de la actina (o la interacción actina-miosina) "media la gemación del VIH" y la liberación. Investigadores de Nueva York y Filadelfia encontraron que el tratamiento con colchicina de células "MOLT4/HIV-1IIIB indujo polarización de linfocitos, redistribución de la actina F en un pseudópodo, y secreción del VIH desde el pseudópodo", y que las partículas "se observaron exclusivamente en la punta del pseudópodo" (65). Dos de los estudios que examinaron el papel de la actina y la miosina en la "partícula de VIH" en gemación y liberada fueron llevados a cabo por investigadores de Japón. En una publicación los autores concluyeron: "Puesto que la actina F es esencial para el mantenimento de la forma de la célula y la función celular, la polarización de la actina F podría cambiar la configuración de la membrana celular o la fragilidad celular, que puede ser esencial para la liberación del VIH" (67). En el otro estudio, los autores "demostraron que la miosina y la actina se colocalizaban en el sitio donde geman las partículas virales. En particular, la miosina se concentró en la misma zona de la membrana plasmática como los puntos densos de las partículas virales. Por el contrario, la actina estuvo ampliamente distribuida en la membrana plasmática, y siempre se encontró siempre en zonas donde las partículas virales estaban presentes". Concluyeron: "la actina podría participar con la miosina en un proceso activo que conduce a la liberación de partículas virales de la membrana". Debido a que estos investigadores, como muchos otros, son de la opinión de que "la iniciación de la interacción actina-miosina requiere un aumento del calcio intracelular libre", han realizado un experimento preliminar utilizando dos quelantes de calcio, uno BAPTA, que consideran que solamente quela calcio libre intracelular, y el otro EGTA, que en su opinión solamente quela el calcio libre en el lado exterior de la célula. Encontraron que "la liberación de VIH-1 se suprimió de un modo más remarcado cuando tanto el calcio libre interior como el exterior fue quelado, y la inhibición fue más fuerte con el quelador exterior que con el interior. A partir de estos resultados, sugerimos que el [Ca2+]o podría entrar en la célula mediante la estimulación de la gemación viral en sí misma en el sitio donde gema ... podría ser difícil detectar un incremento de [Ca2+]i ... porque el mecanismo de gemación va en una forma continua y lenta en una región muy estrecha sin ninguna sincronización" (64).

En la actualidad también existen datos acerca de que:
(a) hay una asociación entre la redistribución de la actina polimerizada, la miosina y otras proteínas celulares (glicoproteínas) y muchos procesos celulares, incluyendo gemaciones no relacionadas con la liberacion del VIH (69-73);
(b) la polimerización de actina, la interacción de la actina-miosina y la reticulación de polímeros en general están reguladas por el estado redox, llevando la oxidación a la interacción (74-76);
(c) tanto los pacientes de sida como los cultivos derivados de los pacientes de sida están sometidos a agentes oxidantes. De hecho, para la detección de las proteínas y partículas del "VIH", los cultivos celulares deben estar estimulados (tratados con agentes oxidantes) (77)). Hace diez años Montagnier escribió: "En efecto, la infección LAV de células T4 en reposo no conduce a la replicación viral o a la expresión de antígeno viral en la superficie celular, mientras que la estimulación mediante lectinas o antígenos de las mismas células da como resultado la producción de partículas virales, expresión antigénica y efecto citopático" (78).
(d) en presencia de antioxidantes no se observa ningún fenómeno del "VIH" (77, 79, 80). En un estudio presentado en la Conferencia Internacional sobre el sida de este año, investigadores de Roma informaron de que "los resultados obtenidos utilizando 3-ABA, NAC [antioxidantes] y un tratamiento combinado 3-ABA/NAC suministrado junto parece confirmar el papel del equilibrio redox intracelular en la modulación de la expresión del VIH. De hecho, se observó una reducción significativa en el número de partículas virales en cultivos que han recibido el tratamiento combinado con NAC/ABA" (81).

Teniendo en cuenta los datos anteriores, ¿se puede tener la tentación de especular que las partículas y proteínas del "VIH" no son más que "material completamente no viral", causado por los agentes a los que los pacientes y los cultivos de sida están expuestos?


Conclusión

La afirmación "anticuerpos contra la cepa de VIH de Montagnier, el estándar global de todos los 'tests del VIH' " presupone la prueba de:
(a) la existencia de más de una "cepa de VIH", entre ellas la de Montagnier. Solamente se puede tener tal certeza mediante el aislamiento del retrovirus. Sin embargo, los datos de Montagnier no prueban el aislamiento de un retrovirus;
(b) la existencia de proteínas inmunogénicas específicas del "VIH". De nuevo, tal prueba solamente puede obtenerse mediante el aislamiento del retrovirus;
(c) anticuerpos inducidos específicamente por la infección de VIH. Es cierto que para la detección de estos anticuerpos no se necesita utilizar el VIH o las proteínas inmunogénicas del VIH. Por ejemplo, los tests serológicos para la mononucleosis infecciosa y para la sífilis emplean anticuerpos derivados de glóbulos rojos de caballo y de corazón de buey, respectivamente, prediciendo no obstante la infección con el virus Epstein-Barr o con Treponema pállidum. Sin embargo, el único modo de probar que los "anticuerpos del VIH" se dirigen contra el "VIH", es decir, el único modo de utilizar el test de anticuerpos para demostrar la infección por VIH, es presentar datos que prueben que los anticuerpos son específicos al VIH. Tal prueba se puede obtener solamente mediante el uso del aislamiento del VIH como estándar oro. Puesto que esto no se ha realizado, no es posible decir que "el estándar global de todos los 'tests del VIH' " prueben la infección por VIH.


6. ADN del VIH

En el debate sobre la prueba de la existencia de un agente retroviral exógeno singular, no se puede adoptar como premisa inicial ("ADN's del VIH-1 y VIH-2 de longitud completa") lo que está supeditado a la prueba de la discusión ("ergo ... el VIH existe y ha sido aislado"). La designación a priori de un fragmento específico de ADN como "ADN del VIH", simplemente esquiva la cuestión a examen.


6.1 Datos mínimos requeridos para probar la existencia del ADN del VIH

Si el "ADN del VIH" es el genoma de una partícula retroviral singular, entonces el requisito más básico es la prueba de la existencia de una entidad molecular singular "ADN del VIH", es decir, fragmentos singulares de ADN identicos, tanto en composición como en longitud, en todos los individuos infectados. La afirmación de que un tramo de ARN (ADNc) es una entidad molecular singular que constituye el genoma de un retrovirus singular puede aceptarse sí, y solamente sí, se demuestra que el ARN pertenece a una partícula con las características morfológicas, físicas y de replicación de una partícula retroviral. La prueba de estas propiedades solamente se pueden obtener mediante la purificación de las partículas supuestamente virales, es decir, obteniendo las mismas separadas de todo lo demás, extrayendo los ácidos nucléicos, y demostrando que tales partículas son idénticas (sus constituyentes, incluyendo sus ácidos nucléicos, son idénticos) e infecciosas. Los procedimientos correctos, que ya han sido utilizados durante más de medio siglo para tener esta prueba, requieren la demostración de que:

1. En cultivos (cocultivos) de células "infectados" hay partículas con un diámetro de 100 a 120 nm, que contienen "cuerpos interiores condensados (núcleos)" y superficies "salpicadas de protuberancias (puntas, botones)" (82);
2. En gradientes de densidad de sacarosa las partículas se concentran a una densidad de 1,16 g/ml;
3. En la densidad de 1,16 g/ml no hay nada más que partículas con las características morfológicas de las partículas retrovirales;
4. Las partículas contienen solamente ARN, y no ADN, y el ARN tiene de modo consistente la misma longitud (número de bases) y composición, no importa el número de veces que se repita el experimento;
5. Cuando las partículas se introducen en cultivos secundarios, pero teniendo en cuenta la advertencia crítica discutida después:
(a) las partículas son absorbidas por las células;
(b) el ARN completo se transcribe de forma inversa en ADNc;
(c) el ADNc completo se inserta en el ADN celular;
(d) el ADN se transcribe en ARN, el cual se traduce en proteínas;
6. Como resultado de 5 las células en los cultivos secundarios liberan partículas en el medio de cultivo;
7. Las partículas liberadas en los cultivos secundarios tienen exactamente las mismas características que las partículas originales, es decir, deben tener morfología idéntica, concentrarse a 1,16 g/ml, y contener el mismo ARN y las mismas proteínas.

La advertencia es que mientras que la introducción de la mayoría de partículas infecciosas en los cultivos de células, y la posterior liberación de partículas es la prueba de que tales partículas son realmente infecciosas, esto no es suficiente para el caso de los retrovirus. El fundamento de esta excepción es el hecho de que "una de las características más notables que distingue a los retrovirus de todos los demás virus animales es la presencia en los cromosomas de células no infectadas normales, de genomas con parte de los virus infecciosos (83). De hecho, una célula puede contener el genoma de muchos retrovirus. Ya en 1976 los retrovirólogos reconocieron que "el fracaso en aislar virus endógenos procedentes de ciertas especies podría reflejar las limitaciones de las técnicas de cocultivación in vitro" (84). En otras palabras, el encontrar un retrovirus en los cultivos-cocultivos "infectados" primario y secundario no es una prueba de que las células se hayan infectado con un retrovirus exógeno.

Un modo que sugeriría, pero no probaría, que las células adquieren el virus desde el exterior (retrovirus adquirido de modo exógeno, retrovirus infeccioso), y no han ensamblado un retrovirus a partir de información ya existente en las células normales (retrovirus endógeno), es realizar experimentos que utilicen controles, es decir, llevar a cabo cultivos-cocultivos de control en paralelo con los cultivos-cocultivos de test. La única diferencia entre el cultivo de test y de control debería ser la introducción de partículas en los cultivos de test. Es decir, aparte de la introducción de partículas, en todos los demás aspectos los cultivos de control deben ser tratados idénticamente. Por ejemplo:

(a) debido a que la detección de RT y secuencias genéticas retrovirales, y la liberación de partículas retrovirales, depende del estado metabólico de las células, el estado fisiológico de las células utilizadas en los cultivos de control debería ser lo más cercano posible al de los de pacientes de sida;
(b) puesto que el mero hecho de la cocultivación, por sí misma, puede llevar a la liberación de partículas retrovirales endógenas, si las células de test se cocultivaron, también se deberían cocultivar las células utilizadas en experimentos de control (85);
(c) los fragmentos, incluso procedentes de células normales no estimuladas, cuando se añaden a los cultivos podrían aumentar la expresión retroviral endógena (86). Debido a esto, cuando las células se cultivan con "VIH" (sobrenadante o material que se concentra a 1,16 g/ml), los controles deben cultivarse con material similar a partir de cultivos de células procedentes de individuos enfermos con enfermedades similares al sida, es decir, emparejando individuos que están inmunosuprimidos;
(d) la aparición de retrovirus endógeno se puede acelerar y el rendimiento aumentado un millón de veces mediante la estimulación de los cultivos con mitógenos (87), mutágenos, carcinógenos y radiación (88, 89). Si los cultivos de test están expuestos a, o emplean tales agentes, también deberían los controles;
(e) puesto que los pacientes de sida y aquellos en riesgo de desarrollar el síndrome están expuestos a fuertes agentes oxidantes (79, 90), las células de control deberían también proceder de tales pacientes;
(g) para evitar el sesgo del observador y en los mejores intereses de la ciencia, se debería realizar examen a ciegas de los cultivos-cocultivos de test y control.


6.2 Datos de la existencia del "ADN del VIH"

6.2.1. En 1984, en el primero de dos artículos, Montagnier y sus colegas describieron el siguiente experimento: "Debido a que el LAV puede provocar la fusión de las células T, y puesto que se sabe que el EBV [virus Epstein Barr] tiene una actividad de fusión en las células B, realizamos experimentos de coinfección de linfocitos no fraccionados (B y T) con ambos virus. Era de esperar que se formarían hibridos estables de células T infectadas con LAV y de células B transformadas con EBV, y que tales híbridos serían capaces de producir LAV de modo continuo. Se intentaron algunos regímenes. El que dio lugar a infección productiva continua de LAV fue el siguiente: linfocitos completos de F.R. fueron estimulados en primer lugar durante 24 horas con la proteína A, e infectados entonces con una cepa de EBV, M81, derivada de un carcinoma nasofaríngeo. Cinco días después, la mitad de este cultivo se infectó con el LAV según se describe (1), y fue entonces dividido en dos subcultivos: uno fue cultivado en un medio carente de factor de crecimiento de células T (TCGF: interleucina-2), el otro en un medio conteniendo TCGF. Como era de esperar, el cultivo alimentado con TCGF produjo LAV, detectado por un pico de actividad de RT que apareció entre el día 12 (6 días tras la infección por LAV) y el día 21 en el sobrenadante. En cambio, las células cultivadas en ausencia de TCGF no produjeron ninguna RT detectable ... En el día 19, en el momento del declive de la producción de LAV, un subcultivo de las células alimentadas con TCGF recibieron células T frescas del mismo donante: estas células T habían sido activadas durante tres días con fitohemaglutinina (PHA) ... Seis días después (día 25), apareció un nuevo pico de RT, pero a diferencia de la primera infección, no fue transitoria ... En el momento de la segunda infección con LAV, pudieron verse fácilmente grandes células redondas transformadas por el EBV en este cultivo, así como en el cultivo de control no infectado con LAV, indicando que ya había ocurrido la inmortalización de las células B mediante el EBV. A la línea de células B inmortalizadas se la denominó RF8" (29). [La referencia 1 a la que se refiere Montagnier es el artículo de 1983 en el que Montagnier et al describieron el primer "aislamiento" del VIH (ver 5)]. En el segundo estudio, 200 ml de sobrenadante de las células FR8 "infectadas con el VIH" se concentraron en gradientes de sacarosa, "se acumularon fracciones que contienen virus" y se centrifugaron (no se dice como determinaron la existencia de "virus", en que banda(s) (fracción(es)) se encontró el virus, o en cuantas bandas, si en alguna, se encontraron partículas, o por qué hubo más de una banda (1,16 g/ml) conteniendo el "virus"). El sedimento se incubó con algunas sustancias, dATP, dGTP, dTPP, dCTP incluyendo 32dCTP y un cebador oligo(dT). A partir de los ADNc's obtenidos así, se caracterizaron adicionalmente tres clones "pLAV13, 75 y 82, llevando insertados de 2,5, 0,6 y 0,8 kilobases (kb) respectivamente". Los tres insertados tienen un patrón de restricción común en un extremo, indicativo de un sitio de iniciación común. "El fragmento común HindIII-PstIpar de par de base 50 (bp) se secuenció y se mosró que contenía un tramo de oligo (dA) anterior a la cola dC de clonación. De este modo, los clones son copias del extremo 3' de un ARN poli-A. La especificidad de la pLAV13 se determinó en una serie de experimentos de hibridación de filtro utilizando inserto pLAV13 traducida en corte como sonda". En primer lugar, "por medio de una técnica de blot-spot adaptada", testearon el sedimento obtenido a partir del sobrenadante de linfocitos normales y células CEM "infectadas con LAV", así como los linfocitos no infectados. Los sedimentos "infectados" fueron positivos y los no infectados negativos. "En segundo lugar, la sonda detectó ADN en los Southern blots de linfocitos T y células CEM infectados con LAV. No se detectó hibridación en el ADN de linfocitos no infectados o de hígado normal". No se dan detalles respecto al método utilizado para producir "infección", pero parece que las células normales y las células CEM fueron cultivadas con sobrenadante de las células FR8, es decir, ¡el mismo sobrenadante que utilizaron para obtener la sonda! Concluyeron: "Juntos, estos datos muestran que el ADN pLAV13 de LAV es exógeno al genoma humano y detecta formas de ARN y ADN integrado, derivadas de las células infectadas con LAV. De este modo, el pLAV13 es específico al LAV" (91).

6.2.2. En mayo de 1984 Gallo y sus colegas publicaron cuatro artículos. Para "aislar" el VIH utilizaron una línea de células leucémicas, que llamaron HT. Es imposible saber con que tejidos de pacientes de sida se cultivo la línea de células. Al leer los artículos de mayo de 1984 se obtiene la impresión de que la línea de células HT se cultivó con fluidos concentrados (sobrenadante) procedentes de cultivos invididuales de células T estimuladas de un paciente de sida. Posteriormente, la investigación a Gallo encontró que la línea de células HT se cultivó con fluidos concentrados acumulados inicialmente a partir de cultivos individuales de tres pacientes, y finalmente a partir de cultivos individuales de diez pacientes (92). La investigación a Gallo encontró este procedimento como "de dudoso rigor científico". Un científico describió el procedimiento como "una locura" (93). En 1985, Gallo y sus colegas escribieron: "La línea de células H9/HTLV-IIIB se deriva de la línea de células T humanas HT, siguiéndole el cocultivo con linfocitos T obtenidos de algunos pacientes de sida, y contiene muchas formas distintas de HTLV-III" (94). A la detección de retrotrasncripción del A(n).dT15 en el sobrenadante se la consideró como prueba de que las células HT estaban con un retrovirus, el VIH, que se originaba de los tejidos de los pacientes. Se obtuvo un clon, el H9 de la línea de células HT, "utilizando sangre irradiada de un donante sano como alimentador" (21). Las células H9 se cultivaron con sobrenadante procedente de las células HT infectadas con "VIH". El sobrenadante de H9 se hizo bandas mediante gradientes de densidad de sacarosa, y al material que se concentró a 1,16 g/ml que, sin ninguna prueba, Gallo y sus colegas consideraron como sinónimo de partículas retrovirales, fue "lisado con dodecil sulfato de sodio (SDS), digerido con proteinasa K, y directamente cromatografiado en una columna de celulosa de oligo(dT). El poliadenilato resultante [poli (A)] conteniendo ARN se utilizó como plantilla para sintetizar ADN complementario etiquetado como 32P (ADNc), en la presencia de cebadores oligo(dT). El tamaño del ADNc resultante varió de 0,1 a 10 kb. Cuando estos ADNc's etiquetados se hibridaron a [poli (A)] conteniendo ARN purificado de células H9 infectadas [es decir, células cultivadas con los mismos sobrenadantes que aquellas de las que fue obtenido la sonda] y no infectadas, así como otras líneas de células humanas no infectadas, solamente las células H9 infectadas contuvieron secuencias de ARN homólogas, como se evidenció mediante bandas de ARN discretas tras la hibridación Northern. La figura 1 muestra que las preparaciones de ADNc a partir de HTLV-IIIB y HTLV-IIIZ dieron patrones idénticos, detectando especies de aproximadamente 9,0 ; 4,2 y 2,0 kb ... Estas bandas son similares en tamaño a aquellas correspondientes al ARNm de tamaño genómico (ARNm), y unieron ARNm's de secuencias env y pX previamente observadas en células infectadas con el HTLV-I, de conformidad con la relación esperada de estos virus. Además, se detectaron las bandas de ARNm virales de células infectadas con HTLV-II con una sonda de ADNc de HTLV-III, y de nuevo los tamaños del ARNm fueron como aquellos del HTLV-I" (56).

En otro estudio de Gallo y sus colegas, ADN extracromosómico de células H9 "infectadas" se extrajo y "se le realizó ensayo para determinar su contenido de ADN viral no integrado", utilizando el ADNc etiquetado 32P como una sonda viral. "Se detectó en primer lugar un ADN viral lineal no integrado tras 10 horas [de "infección], y también estuvo presente en los puntos de tiempo posteriores. La figura 1 muestra un Southern blot del muestreo de 15 horas. Una banda de unos 10 kilobases (kb) en el ADN no digerido representa la forma lineal del HTLV-III no integrado" (95). Todavía en otro estudio Gallo y sus colegas reportaron que "Desde que se encontró que el provirus HTLV-III carecía de sitios de restricción Xba I, se contruyó una biblioteca genómica utilizando ADN de H9/HTLV-III digerido con Xba I, y esto se examinó con una sonda de ADNc de HTLV-III para obtener clones moleculares de provirus integrados de longitud completa con secuencias celulares flanqueadas. Catorce de esos clones se obtuvieron a partir de una biblioteca enriquecida de 106 fagos recombinantes, de los cuales dos fueron purificados en placa y caracterizados. La figura 1 ilustra los mapas de restricción de estos dos clones, designados como lHXB-2 e lHXB-3. La longitud total de los provirus HTLV-III es de aproximadamente 10 kilobases ... Para determinar si el genoma del HTLV-III contiene secuencias homólogas al ADN humano normal, se aisló lXB-2, traducido en corte y utilizado como sondear ADN celular infectado y no infectado con HTLV-III. Bajo condiciones estándar de hibridación ... esta sonda hibridó a ADN a partir de de células H9/HTLV-III, así como otras células infectadas con HTLV-III, pero no a ADN a partir de células H9 no infectadas, células HT no infectadas (la línea parental a partir de la cual se clonó el H9), o tejidos humanos normales (datos no mostrados). Este hallazgo es coherente con los resultados de otros experimentos en donde se utilizó la forma no integrada (intermediario replicativo) del HTLV-III como una sonda, y demuestra que el HTLV-III es un retrovirus exógeno que carece de las secuencias de ácidos nucléicos derivadas del ADN humano" (96).

6.2.3. En 1984, Levy y sus colegas cultivaron PBMC's de un paciente que sufría de sarcoma de Kaposi con IL-2, polibreno y PHA. El sobrenadante se testeo en búsqueda de RT, las células para reacción con el suero del paciente del Instituto Pasteur BRU, y "algunos cultivos se examinaron en búsqueda de virus con microscopía electrónica". Se consideró como prueba el encontrar un resultado positivo con "cualquiera de estos tests". El sobrenadante de uno de estos cultivos se "inoculó en PMC's humanas frescas, estimuladas 3 días antes con fitohemaglutinina". Dentro de 6 días, el sobrenadante de este cultivo tuvo una alta actividad de RT, y se dijo que esto representaba "el aislamiento de virus ARV-2" (97). La línea de células HUT78 se cultivó con ARV-2". En la HUT78 "se monitorizó la producción de virus mediante la medición de actividad de transcriptasa inversa". Cuando hubo una actividad de RT máxima, el sobrenadante fue "centrifugado, y el sedimento resuspendido, tras su tratamiento con ADNasa, se centrifugó en gradientes de densidad. El ácido nucléico de cada fracción se sometió a electroforesis en gel de sacarosa. La región en el gel conteniendo unas "especies de ARN de unos 9 kb fue recortada" y utilizada para obtener "una sonda de ADNc radioactiva". El ADN de la línea de células HUT78 cultivada con "ARV-2" fue digerida con enzimas de restricción, electroforizadas en gel de sacarosa y hechas Southern blot utilizando la "sonda de ADNc radioactiva". "No se detectaron bandas específicas en varias digestiones de ADN de células no infectadas ... mientras que se observaron bandas en células infectadas ... el ADN sin digerir de células infectadas contuvo una especie a 5,5 kb, una especie débil a 6 kb, y una banda ancha en el límite de exclusión del gel (>15 kb). Sugerimos que las especies de ADN de 5,5 kb y 6 kb representan ADN viral no integrado en una configuración circular conteniendo respectivamente uno o dos repeticiones terminales largas (LTR's); la banda ancha superior (> 15 kb) representa provirus integrado en el ADN de la célula huesped". En un experimento adicional, "el ADN de células completas procedente de células infectadas con ARV-2 fue parcialmente digerido con ECORI; el ADN celular de 9-15 kb se clonó en un vector I bacteriófago EMBL-4, y se identificaron fagos recombinantes con la sonda cd ADNc específica de virus". Entre el fago recombinante obtenido estuvieron el l-9B y el l-7A, cada uno de los cuales fue de 9,5 kb (98).


6.2.4 Resumen y discusión

Es obvio que, aunque Montagnier, Gallo y Levy y sus respectivos colegas hacen referencia a purificación o aislamiento de viriones o partículas de virus, ninguno de estos grupos han presentado pruebas del aislamiento de partículas retrovirales, o incluso el aislamiento de partículas con aspecto viral, el primer paso y absolutamente necesario para demostrar la existencia de un genoma retroviral (en el momento de escribir esto, tampoco ningún otro grupo de investigadores VIH-sida). No constituye tal prueba el encontrar algunos ARN que se concentran en la banda de 1,16 g/ml, el seleccionar de ahí una fracción rica poli-A, o un fragmento de una determinada longitud, incluso si se encuentra que es siempre de la misma longitud y secuencia, y referirse a él como el HTLV-III, LAV, ARV. Debe enfatizarse que incluso si el ARN está incorporado en una partícula que en gradientes de densidad de sacarosa se concentra en la banda de 1,16 g/ml, esto no es todavía ninguna prueba de que sea un ARN retroviral. Según John Coffin, uno de los mejores expertos conocidos en genoma retroviral, hay partículas "con un complemento completo de proteínas virales, pero las partículas contienen una colección de ARN's celulares, y sólo alrededor del 1% de ARN genómico ... el ensamblaje de partículas no requiere el genoma ... en su ausencia otras moléculas de ARN podrían estar substituidas" (83). Es importante notar que aunque todos los grupos, el de Montagnier, el de Gallo y el de Levy, se refieren al material de los sobrenadantes de cultivos que en gradientes de densidad de sacarosa se concentra en la banda de 1,16 g/ml como partículas virales, viriones, y al ARN y las proteínas a esa densidad como ARN o proteínas "asociados a partícula", ninguno de los grupos presentó pruebas de la existencia a esta densidad de ninguna partícula, con aspecto retroviral o de cualquier otro aspecto, pura (aislada) o en cualquier otra condicion. En cambio estos investigadores cultivaron linfocitos de pacientes de sida y los estimularon (activaron) con una amplia variedad de agentes. La transcripción inversa de A(n).dT15 en el sobrenadante del cultivo se consideró prueba de infección con un retrovirus, o incluso prueba de aislamiento. Los sobrenadantes de estos cultivos se introdujeron en cultivos de líneas de células leucémicas o transformadas. Con los sobrenadantes de estos cultivos se realizaron dos tipos de experimientos:
(a) Los sobrenadantes fueron hechos bandas mediante gradientes de densidad de sacarosa. En la banda de 1,16 g/ml (y a veces en otra banda o bandas, al menos en los experimentos del grupo de Montagnier, esto no está claro), encontraron fragmentos de ARN de ciertas longitudes (aunque no hubo dos que tuviesen la misma longitud), o que eran ricos en adenina (fragmentos ricos poli-A)), y los llamaron "ARN del VIH", el "genoma del VIH". Utilizando un cebador (dT), el "ARN del VIH" se transcribió en ADN complementario (ADNc);
(b) Los sobrenadantes se introdujeron en otro conjunto de líneas de células leucémicas y transformadas, así como en cutivos estimulados de células T normales. El ADN de estas células, así como el ADN de los cultivos a los que no se añadió sobrenadante, se hibridaron utilizando sondas del ADNc. Se obtuvieron resultados positivos solamente con el ADN de las células a los que se añadieron los sobrenadantes. Estos hechos se interpretaron como una prueba de que el "ADN del VIH", el retrovirus, se originó a partir de los pacientes de sida, y de hecho que estos pacientes lo adquirieron desde el exterior, es decir, que el retrovirus era exógeno.

Hay muchos problemas asociados con estos experimentos y su interpretación. Su conclusión plantea muchas preguntas, siendo las más obvias:
1. Se dice que el VIH es un retrovirus, y los retrovirus son partículas que contienen, entre otras cosas, ARN. ¿Cómo es posible entonces afirmar que el ARN que se concentra en la banda de 1,16 g/ml, el "ARN del VIH", es el genoma de un retrovirus sin pruebas de que es un componente de una partícula, viral o no viral, que se concentra en esa densidad?
2. La RT no es específica a los retrovirus y, de hecho, el A(n).dT15 puede transcribirse de forma inversa por todas las ADN polimerasas celulares alfa, beta y gamma. ¿Es posible entonces considerar la transcripción inversa de A(n).dT15 como prueba de aislamiento de VIH o incluso como la detección de un retrovirus?. Incluso si el proceso de la transcripción inversa fuese específico a los retrovirus, ¿puede la detección de un proceso ser considerado como prueba del aislamiento de un objeto, en este caso, partículas retrovirales?
3. Los sobrenadantes de cultivos celulares contendrán tanto ADN como ARN, incluyendo algunos encerrados en desechos celulares (fragmentos), especialmente si la viabilidad celular no es del cien por cien, como en el caso de los cultivos utilizados por los tres grupos. Los ARN's podrían incluir ARN mensajero (que es rico en adenina), así como ARN nucléico heterogéneo de alto peso molecular. Estos ARN's, además de tener un alto peso molecular y la heterogeneidad del tamaño, también tienen poli-A, con el poli-A unido en el extremo 3' de la molécula, y podrían ser resistentes a la RNasa. La actinomicina inhibe su síntesis, y también interfiere con su procesamiento y descomposición adecuados (99). De la virología de animales también se sabe que ARN y ADN no retrovirales tambien se concentran en la banda de 1,16 g/ml (100). ¿Cómo es posible entonces afirmar que simplemente porque un ARN se concentra en la banda de 1,16 g/ml y es rico en adenina, o tiene una cierta longitud, es "ARN del VIH"? Si este ARN es "ARN del VIH", entonces qué es el otro ARN y el ADN que también se concentra a esta determinada densidad? Si estos últimos son celulares, ¿por qué no el ARN poli-A también?
4. Por definición, los retrovirus son partículas infecciosas que contienen solamente ARN. Cuando entran en una célula el ARN se transcribe de forma inversa en ADN, que se integra entonces en el ADN celular como un provirus, lo que significa que el "ADN del VIH" estará presente solamente en la célula, y en ninguna otra parte. Sin embargo, muchos expertos del VIH, incluyendo a Gallo, mostraron que tanto los sobrenadantes de cultivos celulares "infectados" como las "partículas de VIH", es decir, el material que se concentra en la banda de 1,16 g/ml, contienen "ADN del VIH", el cual "puede integrarse directamente en el ADN cromosómico huesped" (101-103). Entonces surge la pregunta: ¿es el ADN del VIH el resultado de la transcripción inversa del "ARN del VIH" o es al revés?
5. Se acepta que el ARN del VIH está localizado en un núcleo condensado rodeado de una "envoltura lípida de dos capas derivada de la membrana celular de la célula huésped, salpicada con la gp120 codificada viralmente y la proteína miristilada p17. El llamado enlace de envoltura del núcleo (CEL) sujeta el núcleo a la envoltura" (103). Uno de los hechos mejor conocidos en biología es que los núcleos condensados (cromatina) son transcripcionalmente inactivos. Este es uno de los motivos por el que los virus, incluyendo a los retrovirus, para multiplicarse deben primero entrar en las células, donde la cromatina se descondensa. Sin embargo, en un artículo publicado en 1993 por Hui Zhang y sus colegas, incluyendo Poiesz, del Suny Health Science Center de Syracuse, Nueva York, escribieron: "Hemos demostrado que, en ausencia de detergente, se pueden sintetizar grandes cantidades de ADN viral resistente a la RNasa dentro de viriones VIH-1 intactos, indicando que este fenómeno no depende de la perburbación de la envoltura viral [sin mencionar la descondensación de la cromatina]. También se produjo la síntesis de ADN viral naciente en viriones purificados incubados a 37 grados en fluidos fisiológicos humanos libres de células, incluyendo el plasma seminal, la leche materna y los líquidos fecales" (103). Esto significa que:
(i) los viriones "VIH-1 intactos" desarrollan una función que ningún otro sistema biológico con la cromatina muy condensada y protegida puede realizar, o
(ii) el "ARN del VIH" encontrado en los sobrenadantes o en los "viriones purificados" está presente en una forma incorpórea, o
(iii) los "ARN's del VIH" se sintetizan de novo en los cultivos celulares (ver 6.3.5);
6. En la actualidad existen muchos datos acerca de que cualquier ARN o ADN presente en el sobrenadante, con independencia de su origen, especialmente cuando las células son estimuladas con policationes y agentes oxidantes, será absorbido por las células (ver 7.1). ¿Cómo es entonces posible afirmar que una señal de hibridación positiva en las células cultivadas con el mismo "ADN de VIH" que contiene sobrenadante como el sobrenadante a partir del cual se originó la sonda "ADN de VIH", pero no en otras células, es una prueba de que el "ADN del VIH" es el genoma de un retrovirus exógeno?
7. El primer paso absolutamente necesario para probar que el "ADN del VIH" se originó a partir de células de linfocitos de pacientes con sida y aquellos en riesgo, es llevar a cabo experimentos de hibridación utilizando el ADN de sus linfocitos frescos sin cultivar, y el "ADN del VIH" como una sonda. Es difícil entender por qué ni el grupo de Montagnier ni el de Levy reportaron tales experimentos. El grupo de Gallo sí lo hizo, y los resultados fueron negativos (ver 6.4.4). ¿Cómo es entonces posible afirmar que el "ADN del VIH" es el genoma de un retrovirus exógeno originado de los pacientes de sida y aquellos en riesgo?
8. Leyendo el artículo fundamental del aislamiento del VIH titulado "Detection, Isolation and Continuous Production of Cytopathic Retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and Pre-AIDS", se tiene la impresión de que la línea de células HT leucémica que Gallo, Popovic y sus colegas utilizaron era una línea de células nueva, y una que establecieron. La investigación de Gallo reveló que la línea de células HT (H9) es la misma que la utilizada por el grupo de Levy, HUT78, una línea de células leucémicas establecida en otro laboratorio. Sin embargo, los abundantes datos acerca de la existencia de retrovirus humanos endógenos se ha obtenido en gran medida a partir de experimentos en células leucémicas o transformadas. Existen datos de que tanto la H9 como los linfocitos B trasnformados EBV liberan partículas con aspecto retroviral incluso cuando no están "infectados con el VIH" (104). Además, la línea de células HUT78 (H9) se estableció a partir de un paciente con "malignidades de células T4 maduras", una enfermedad que, según Gallo, está causada por un retrovirus exógeno, el HTLV-I. De hecho, ya en 1983 afirmó haber demostrado que la línea celular HT (H9) contenía secuencias provirales HTLV (105). Según algunos investigadores americanos, los linfocitos B de sangre periférica humanos normales transformados EBV contienen transcripciones relacionadas con el HTLV-I (106). Puesto que todas las partículas retrovirales, por definición, se concentran en la banda de 1,16 g/ml, en el supuesto de que todos los grupos tuviesen un retrovirus a esta densidad, ¿cómo es posible afirmar que el retrovirus procedente de la HUT78 y los linfocitos B transformados EBV, es un nuevo retrovirus VIH, y no uno que ya estaba presente? ¿Se puede afirmar que el "ARN del VIH", y por tanto las sondas e cebadores a partir de él, son el ARN y las sondas e cebadores de un genoma retroviral exógeno singular?
9. El dogma biológico establece que el ADN se sintetiza en un ADN plantilla, el ARN en un ADN plantilla, y las proteínas en un ARN plantilla. Es decir, el único modo de que una célula adquiera entidades de ácido nucléico nuevas, es el ser introducidas desde el exterior, de modo exógeno, bien desde otro tipo de célula, un agente infeccioso o un ácido nucléico sintético. Si el dogma biológico es correcto, entonces el "ARN del VIH", ya sea una entidad molecular celular o viral, debería haberse originado bien a partir de los linfocitos de los pacientes o bien a partir de las líneas de células transformadas y leucémicas. Sin embargo, cuando "el ADNc del VIH" se utilizó como una sonda, ni uno de los grupos reportó resultados de hibridación positiva de ninguna de las células, ni siquiera de los linfocitos de los pacientes de sida. Surge entonces la pregunta: ¿existe una entidad molecular singular "ADN del VIH"? ¿Qué significa y de dónde se originó?


6.3 Especulaciones sobre el "ADN del VIH"

Si se quiere especular sobre la naturaleza y origen del ARN (ADNc) derivado de los cultivos que contienen tejidos de pacientes de sida y aquellos en riesgo, y que se concentra en la banda de 1,16 g/ml, hay muchas posibilidades.

6.3.1 Aunque hasta la fecha no existen datos al respecto, es posible que el tramo de ARN, actualmente denominado "ARN del VIH", sea el genoma de un retrovirus exógeno, el VIH. Sin embargo, para que esto se considere probado, además de satisfacer todos los requisitos de 6.1, también se debe demostrar que:
(i) el tramo singular de ARN solamente se puede obtener a partir de cultivos de individuos particulares;
(ii) cuando el ARN (o ADNc) se utiliza como sonda para testear linfocitos frescos sin cultivar, se obtiene un test positivo solamente de las células frescas de los individuos que también tienen un cultivo positivo;
(iii) que en animales o humanos, el retrovirus se transmite horizontalmente (de animal a animal, de persona a persona).

6.3.2 El genoma de un retrovirus endógeno, es decir, un tramo de ARN con un correspondiente ADN plantilla presente en el ADN celular de animales no infectados, y que se pasa verticalmente de generación a generación (de padres a hijos a través de la línea de células germinales) y que, bajo ciertas circunstancias, se puede expresar e incorporar en partículas retrovirales. Durante muchas décadas se ha sabido que el ADN de los animales contiene secuencias "estrechamente relacionadas o idénticas con las de los virus infecciosos". Sin embargo, el genoma humano se consideró como una excepción, y no fue hasta 1984 que tanto Gallo como Fauci fueron de la opinión de que "no hay retrovirus endógenos humanos conocidos" (107). De hecho, en los años 70 y en los 80, después de que Gallo afirmara el descubrimiento del HL23V, el HTLV-I y más tarde el HTLV-II, y especialmente después de que Montagnier afirmara el descubrimiento del VIH, se suscitó mucho mayor interés en los retrovirus, con el resultado de que llegó a ser "cada vez más claro que el ADN de los humanos, así como el de otros vertebrados, contiene muchos genomas retrovirales integrados" (25, 108) y que, en muchos casos, los genes se expresan "incluyendo transcripciones e ARNm relacionados con ADN retroviral endógeno de longitud completa" (109, 110), con marcos de lectura abiertos para las proteínas gag, pol y env (111). En 1987, muchos investigadores informaron de la expresión del genoma del retrovirus endógeno humano, HERV-K, homólogo al virus de tumor mamario de ratón (MMTV). "En algunas líneas de células, el genoma HERV-K se expresó como un poli(A)+ ARN de 8,8 kilobases que parece ser la transcripción de longitud completa de este genoma". Cuando la línea de celulas de cáncer de mama humano T47D fue "crecida en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero de ternero fetal, la expresión de genoma HERV-K fue débil". Sin embargo, cuando las células fueron tratadas con estradiol y entonces con progesterona, produjeron "partículas de aspecto retroviral y proteína soluble que comparten determinantes antigénicos con el producto del gen env MMTV" (112). En apoyo de su tesis "de que una RT endógena humana podría mediar los movimientos de genes que conducen a la leucemia y al cáncer", investigadores de la Universidad Hahnemann, Philadelphia, incluyendo a David Gillespie, un colaborador de Gallo durante mucho tiempo, "demostraron la presencia de enzima tipo transcriptasa inversa en partículas retrovirales de pacientes con trombocitemia esencial, policitemia vera y leucemia mielógena crónica. Posteriormente se demostró que el genoma humano contiene 50 copias de HERV-K. El HERV-K es un elemento retroviral endógeno humano de clase I que contiene marcos de lectura abiertos gag, pol y env, así como regiones LTR intactas ... Se detectó la expresión de transcripciones de HERV-K ARN genómicas de 9 kb en líneas de células humanas ... Hemos sido capaces de demostrar por primera vez la expresión del gen pol del HERV-K en leucocitos de sangre humanos. El gen pol del HERV-K se expresó en células sanguíneas periféricas a partir de dos conjuntos de individuos no leucémicos. El primer conjunto consistió en 7 donantes normales, mientras que el segundo conjunto consistió en 3 pacientes con PV, de los cuales todos expresaron el gen pol del HERV-K. Cuatro de las cinco secuencias normales contuvieron marcos de lectura abiertos heterogéneos para pol, según se detectó mediante RT-PCR y protección de ARNasa. A diferencia de los donantes normales, que expresan proviruses HERV-K de modo aleatorio, un análisis del pol HERV-K de un paciente PV mostró una expresión selectiva de una familia restringida de provirus relacionados" (113). En 1995, Gallo admitió que la célula humana contiene genomas retrovirales, pero todavía insistió en que son defectuosos: "Los retrovirus se transmiten bien genéticamente (formas endógenas) o como agentes infecciosos (formas exógenas). Como hacen muchas otras especies animales, los humanos tienen ambas formas ... El ADN de muchas especies, incluyendo los humanos, albergan copias múltiples de distintos provirus retrovirales. Las secuencias provirales endógenas humanas son prácticamente todas defectuosas, y comprenden aproximadamente el uno por ciento del genoma humano" (114). El punto de vista respecto a la defectuosidad no es compartida ni siquiera por Reinhard Kurth quien, con sus colegas, han estudiado extensamente los retrovirus endógenos humanos (115), y han mostrado que las secuencias HERV-K se transcriben, y que una línea de células de teratocarcinoma humano, la GH, que contiene estas secuencias, cuando se examinó mediante ME se encontró que producían "partículas de retrovirus humanas derivadas de teratocarcinoma (HTDV)". En 1993 Kurth y sus colegas reportaron que en la línea de células GH, "se podían identificar cuatro especies de ARNm virales, incluyendo un ARNm de longitud completa. Las otras tres ARNs subgenómicas se generaron mediante eventos de unión simples o dobles ... El análisis de secuencia de los genomas HERV-K expresados revelaron genes gag no defectuosos, un requisito previo para la formación de partículas. Los marcos de lectura abiertos también se observaron en pol y env. Los antisueros producidos contra proteínas gag recombinantes de HERV-K tiñieron partículas HTDV en inmunomicroscopía, vinculándolas a la familia HERV-K". Al analizar sus hallazgos escribieron: "En Northern blots, la expresión del HERV-K solamente se pudo demostrar en líneas de células de teratocarcinoma, pero no en otras líneas de células. Estudios RT PCR preliminares sugieren, sin embargo, que el HERV-K podría expresarse en muchas, si no en todas las células humanas a niveles demasiado bajos para poder detectarse en los Northern blots. La base de las significativas diferencias cuantitativas en la expresión entre las células de teratocarcinoma y otras líneas de células no está clara. Es intrigante especular que un factor(es) celular podría la síntesis de HERV-K ARNm dependiendo del tipo de célula o el estado de diferenciación. En este contexto, hay que recordar que otros elementos retroid [ERV-9, RTLVL-H, LINE-1] también se expresan preferencialmente en células de teratocarcinoma humanas" (116). Es de interés señalar que Montagnier y sus colegas reportaron su "genoma del VIH" de una línea de celulas transformada, que la línea de células HUT78 de Levy y sus colegas es una línea de células leucémica humana, y que la línea de células H9 de Gallo y sus colegas no es otra que la HUT78, y que por lo tanto debe tener el HTLV-I así como retrovirus endógeno. Es igualmente importante tener en cuenta que, aunque Kurth et al no encontraron ninguna homología de secuencia entre el HERV-K y el "virus linfotrópico T humano", muchos investigadores informaron de secuencias de HTLV-I en el genoma humano, incluyendo en líneas de células derivadas de la teratocarcinoma.

En un artículo publicado en 1985, investigadores de varias instituciones de los Estados Unidos, incluyendo el Laboratory of Tumor Immunology and Biology, National Cancer Institute, Bethesda, se informó que "el ADN humano contiene múltiples copias de una nueva clase de genomas retrovirales endógenos. El análisis de un clon de ADN recombinante humano (HLM-2), que contenía uno de esos genomas provirales, reveló que es un mosaico de secuencias relacionadas con retrovirus, con la organización y longitud de genomas retrovirales endógenos. La repetición terminal de longitud del HLM-2 hibridó con la repetición terminal de longitud del virus de mono de ardilla, un virus tipo D. Los genes pol y gag del HLM-2 comparten homología extensa con los del retrovirus M432. (un retrovirus relacionado con el tipo A), virus de tumor mamario de ratón (un retrovirus tipo B), y el virus de sarcoma de Rous aviar (un retrovirus tipo C). Un análisis de la secuencia de nucleótidos reveló regiones en el gen pol del HLM-2 que fueron hasta un 70% idénticas al gen pol de virus de tumor mamario de ratón. Una porción del supuesto gen env del HLM-2 hibridó con la región correspondiente del genoma viral M432". La región pol del HLM-2 mostró homología con el HTLV-I, el cual, según los autores, "no es endógeno a las células humanas pero se transmite horizontalmente como un virus inductor de tumor infeccioso de los humanos (117).

En 1987 investigadores de Canada reportaron el hallazgo de un "Genoma Tipo Retrovirus Endógeno Humano con secuencias pol y secuencias gag Tipo C relacionadas con los Virus Linfotrópicos de células T Humanos", HTLV-I y HTLV-II (118). En 1989 investigadores del Departamento de Bioquímica de la Universidad de Nueva York mostraron que el "ADN humano contiene un amplio espectro de secuencias de codificación de la transcriptasa inversa relacionada con retrovirus, incluyendo algunas que están claramente relacionadas con el virus de leucemia de células T humano tipos I y II, algunas que están relacionadas con la familia L-I de secuencias largas de nucleótidos intercalados, y otras que están relacionadas con ADN's provirales endógenos humanos previamente descritos. Además, las secuencias relacionadas del virus de leucemia de células T humanas tipo I parecen estar transcritos tanto en células T humanas normales como en líneas de células derivadas de un teratocarcinoma humano" (119). En un artículo publicado en 1989, investigadores de los Estados Unidos resumieron sus hallazgos experimentales como sigue: "Se han clonado secuencias endógenas relacionadas con el virus de leucemia de células T humano (HTLV) tipo I (HRES) a partir de una biblioteca genómica humana. El HRES-1/1 está presente en el ADN de todos los donantes normales examinados. Mediante análisis de secuencia de nucleótidos, el HRES-1/1 contiene dos marcos de lectura abiertos potenciales capaces de codificar una p25 y una p15. Una región 5' lateral 684 del primer codón ATG de p25 contiene una caja TATA, una señal de poliadenilación, un supuesto sitio de unión de cebador ARNt, y repeticiones invertidas en lugares que son típicos de una repetición terminal larga retroviral ... La ubicación genómica del HRES-1/1 es transcripcionalmente activa en células linfoides", incluyendo los linfocitos de sangre periférica humanos normales trasnformados EBV, líneas celulares de leucemia, células de melanoma y tejidos embrionarios (106). En un artículo publicado en 1992 por investigadores de Hungría y Gran Bretaña titulado "secuencias endógenas relacionadas con el virus linfotrópico de células T humanas (HTLV), HRES-1, codifica una proteína 28-kDa: un posible autoantígeno para los autoanticuerpos reactivos a gag HTLV-I", la "se documentó la presencia de una secuencia endógena relacionada con el virus linfotrópico de células T humanas (HTLV), en el genoma humano. La ubicación genómica HRES-1 es transcripcionalmente activa y contiene marcos de lectura abiertos ... se observaron anticuerpos a péptidos sintéticos específicos del HRES-1 en pacientes con MS, esclerosis sistemática progresiva (PSS), SLW, síndrome de Sjogren, y crioglobulinemia esencial (ECG). Los datos sugieren que el HRES-1 podría servir como un autoantígeno y corresponderse con un objetivo natural de los autoanticuerpos reactivos de proteína del núcleo HTLV-I" (120).

6.3.3 El genoma de un retrovirus de novo ensamblado por la recombinación y la supresión genética de:
(a) secuencias retrovirales endógenas;
(b) secuencias retrovirales y celulares;
(c) genes celulares no retrovirales.

En la literatura virológica existen muchos datos mostrando que cuando una célula contiene dos provirus, se puede encontrar progenie que posee el genoma de uno, pero las proteínas estructurales de uno o de ambos virus presentes. A la inversa, el ARN podría ser viral, pero al menos algunas de las proteínas podrían ser celulares. En otros casos, las partículas no tienen un genoma en absoluto, o faltan uno o más genes (virus genéticamente defectuosos). La mezcla genética puede ser entre genomas virales o entre genes virales y celulares (83, 121). Según importantes retrovirólogos, como Weiss y Temin, pueden surgir nuevos genomas retrovirales por la reordenación del ADN celular, causado por muchos factores incluyendo los procesos patogénicos, una visión que propone los retrovirus como un efecto y no como causa de la enfermedad (122, 123). Según Varmus, "los genomas retrovirales se recombinan a alta velocidad (las estimaciones son tan altas como de un 10 a un 30% para cada ciclo de multiplicación), y se cree que las ARN's heterodiméricas son intermediarios, teniendo lugar la recombinación durante la transcripción inversa. La recombinación parece estar fuertemente favorecida por la homología, pero la unión también ocurre ocasionalmente entre secuencias sin relacionar, por ejemplo, durante la última fase de la transducción genética por retrovirus. Cuando los virus se hacen crecer en células que contienen provirus endógenos relacionados, transcripciones encapsidables de estos provirus podrían participar en reacciones de recombinación con el virus exógeno. Esto se revela más dramáticamente mediante la reparación de mutaciones de supresión en el genoma de un virus exógeno, en una forma que se parece superficialmente a la conversión génica". En algunos animales, los provirus se han adquirido "durante la reproducción reciente de las cepas en el laboratorio" y "en unos pocos casos, los provirus endógenos se han establecido o incrementado en número durante las observaciones experimentales" (121) (cursiva nuestra).

Ya en 1974, basandose en los datos entonces disponibles, Howard Temin propuso que los genomas retrovirales (ribodeoxyviruses) se originan de "componentes celulares normales. Las relaciones entre los diferentes grupos de ribodeoxyvirus reflejan las relaciones entre los componentes celulares de las que los virus evolucionaron, y la evolución convergente de los virus. En otras palabras, hay relaciones entre los ribodeoxyviruses porque los ribodeoxyviruses evolucionaron a partir de células que, a su vez, tenían relaciones derivadas de ancestros comunes. Un posible mecanismo de esta evolución se describe en la figura 5". En la leyenda de la figura 5 Temin escribió: "Una sección de un genoma celular se llega a modificar en sucesivas transferencias ADN (W) a ARN (-) a ADN, hasta que llega a ser un genoma ribodeoxyvirus. En primer lugar, estas secuencias evoucionan como parte de un genoma celular. Después de haber escapado como un virus, evolucionan de forma independiente como un genoma de virus. La escala de tiempo podría ser de millones de años en células de línea germinal y de días en células somáticas" (122). Temin reforzó su punto de vista en una publicación más reciente (124).

En 1975 Gallo, Gillepsie y sus colegas escribieron: "Incluso aunque los retrovirus [exógenos] de ARN de clase II muestran una homología mínima al ADN de la célula huésped no infectada, la hibridación de acidos nucléicos entre los virus de leucemia de clase II de disintas especies da un patrón que es el mismo que la relación filogenética entre sus huéspedes naturales ... Hemos propuesto que estos y otros resultados favorecen la interpretación de que todos los virus tumorales de ARN se derivan de genes de la célula, una propuesta que es conforme a la teoría virogenética ... Mediante el análisis del ARN de los virus que infectan y se replican en un nuevo huésped, también se han obtenido datos que indican que el genoma de los virus de tipo C puede cambiarse sustancialmente por el anfitrión, probablemente mediante recombinación con ADN del host" (125). Unos años después, Coffin escribió: "La estrecha relación de las proteínas de virión, así como la homología de ácidos nucléicos en general, deben significar que tanto los virus tumorales de ave exógenos como endógenos [retrovirus] derivan de un ancestro común" (126).

En 1991 investigadores de la Universitad de Nueva York publicaron un artículo publicado, "Implicaciones Evolutivas de los Retrovirus Endógenos Primates". En el análisis de los datos actualmente disponibles escribieron: "Un reciente análisis filogenético detallado de los retrovirus exógenos y endógenos (incluyendo los retrotransposones), sugiere fuertemente que una acumulación de secuencias retrovirales endógenas periódicamente contribuyen a la generación de virus exógenos, y que la presencia de retrovirus primates endógenos está probablemente más directamente relacionada con los virus exógenos de lo que podría haberse pensado (127).

6.3.4 El ARN "nuevo" encontrado en el sobrenadante de cultivo de células, y el material de ahí que se concentra a 1,16 g/ml, el "ARN del VIH", podría no tener nada que ver con un genoma retroviral. Podría ser un ARN obtenido mediante transposición, es decir, mediante ciertas secuencias de ADN replicante (transposones) que llegan a insertarse en otro lugar en el genoma, o mediante retroposición, es decir, mediante ARN particular (retrotransposones) siendo primero trasncrita en ADN, y entonces insertándose de manera similar en el genoma. La retroposición puede "utilizar mecanismos celulares para la retroposición pasiva, así como retroelementos que contienen transcriptasa inversa". Los retroelementos podrían ser elementos de aspecto retroviral o elementos no virales (128,129). La retroposición no puede solamente "formar y remodelar el genoma eucariótico de muchas formas distintas" (128), sino que los retroelementos no virales podrían ser similares a los elementos retrovirales. Según Doolittle et al, de la Universidad de California, San Diego, "... todo el grupo de agentes llevando transcriptasa inversa, incluyendo los retrotransposones y los retrovirus genuinos, han sido recientemente apodados como "retroids". Las comparaciones de secuencia de muchos otros trabajadores dejan pocas dudas de que las transcriptasas inversas de todos los "retroids" considerados aquí son homólogos, es decir, las semejanzas de secuencia no son el resultado de la casualidad o de convergencias. Nuestras propias comparaciones confirman esa idea general, no solamente para transcriptasas inversas, sino también para las ribonucleasas, endonucleasas y proteasas, aunque debería entenderse que no todos los "retroids" contienen las cuatro enzimas ... Todos estos elementos tienen características adicionales en común con los retrovirus, incluyendo LTR (repeticiones de terminal largas) características y sitios de cebador que son complementarios a varios ARNt's. Al igual que los retrovirus, la mayoría contienen enlacés de ácidos nucléicos distintivos y proteínas de partícula de núcleo; en micrografías electrónicas hay una semejanza notable a las cápsides retrovirales ... Acerca de la única característica que distingue regularmente muchos de estos retrotransposones de los retrovirus genuinos, es la ausencia de una proteína de cubierta" (17).

6.3.5 Aunque de que ha pasado medio siglo desde que la premio Nobel Barbara McClintock descubrió el fenómeno de las transposición, que puede conducir a la aparición de nuevos genotipos y fenotipos, en la actualidad es todavía generalmente aceptado que, en cualquier momento, se encuentra un tramo particular de ARN en una célula, por ejemplo, en un linfocito T, a menos que el ARN o ADN se haya introducido desde el exterior, todas las células T, independientemente de su estado fisiológico o tensiones a las que están sujetas, contendrán un tramo correspondiente de ADN. En otras palabras, el ADN (genes) en una célula son invariantes y todas las moléculas de ARN en una célula están subordinados a una longitud correspondiente de ADN. Sin embargo, según McClintock, el genoma puede ser reestructurado, y no solamente por la transposición. En su lectura del Nobel, el 8 de diciembre de 1983, dijo: "una rápida reorganización de los genomas podría subrayar alguna formación de especies. Nuestro conocimiento actual sugiere que estas reorganizaciones se originan de algun "shock" que forzaron al genoma a reestructurarse a sí mismo con el fin de superar una amenaza para su supervivencia ... La reestructuración genómica principal ciertametente acompañó la formación de nuevas especies". El "shock genómico" que lleva al origen de nuevas especies podría ser "bien producido por accidentes que ocurren dentro de la célula en sí misma, o impuesta desde fuera como las infecciones por virus, cruces de especies, venenos de varios tipos, o incluso entornos alterados como los impuestos en los cultivos de tejidos. Somos conscientes de algunos de los contratiempos que afectan al ADN y también de sus mecanismos de reparación, pero muchos otros podrían ser difíciles de reconocer. Se requerirían ajustes homeoestáticos a varios accidentes si estos accidentes ocurren con frecuencia. Muchos de estos contratiempos y sus ajustes no se detectarían a menos que algun evento u observación dirija la atención hacia ellos ... Sin lugar a dudas, vamos a salir de este periodo revolucionario con vistas modificadas de los componentes de las células y como funcionan, pero solamente, sin embargo, para esperar la aparición de la próxima fase revolucionaria que de nuevo traerá cambios sorprendentes en los conceptos" (130) [cursiva nuestra, y ver esta referencia para ejemplos].

En la década de los 80 se descubrió una serie de fenómenos que trajeron cambios sorprendentes en conceptos, incluyendo los siguientes: Hasta finales de 1970, el concepto predominante era que un tramo de ADN contiguo discreto es un gen estructural que codifica la información genética para especificar la fabricación de una sola proteína, y que la secuencia lineal de los nucleótidos en este tramo de ADN se corresponde directametne con las secuencias lineales de los nucleótidos de ARN y con los aminoácidos en la proteína. El primer experimento que contradijo esta creencia fue el descubrimiento de que las secuencias de bases de ADN que codifican una determinada proteína no estaban en un tramo contínuo de ADN, sino que se pueden intercalar con otras secuencias de bases no codificantes, es decir, los genes están divididos, "genes en piezas". Se han postulado distintos mecanismos para explicar esta observación. En una de esas explicaciones, se hipotetiza que el tramo completo de ADN se transcribe en una pieza de ARN, y entonces las regiones no codificantes (intrones) se escinden y las regiones codificantes (exones) se unen para hacer el ARN mensajero apropiado (131).No hya reglas que establezcan un límite superior en el número de intrones en un "gen", algunos genes pueden tener hasta dieciséis o más intrones. Ni tampoco hay reglas con respecto la longitud de los intrones, aunque en general los intrones son mucho más largos que los exones, con la longitud de los exones "alcanzando un máximo de 40 o 50 aminoácidos ... siendo el intrón más corto de 50 bases de longitud, y el más largo extendiéndose hasta unos 50.000 bp" (132).

Según Gilbert los intrones representan "puntos calientes" de recombinación, y se pueden crear nuevos genes "a través del acoplamiento de los exones mediante recombinación mediada por intrón", "los intrones se pierden, y se forman exones más complicados" (133). En la actualidad, existen datos que muestran que al menos algunos intrones son elementos genéticos móviles, elementos de transposición, que se autounen, que contienen con frecuencia marcos de lectura capaces de codificar una proteína, incluyendo "regiones de homología a la transcriptasa inversa dispersas en un tramo de aproximadamente 250 aminoácidos en el medio de cada intrón ORF" (134). El descubrimiento de genes de división "muestra que el aparato genético de la células es más complejo, más dinámico de lo que se había sospechado" (132). Otra visión firmemente sostenida fue la creencia de que todas las reacciones celulares, y por lo tanto la unión de genes estaban catalizadas por una enzima de proteína. A principios de los 80 se encontró que el ARN puede cortarse, unirse y ensamblarse a sí mismo, así como ensamblar otros ARNs que no sean él mismo.

6.3.6 Uno de los puntos de vista más importantes de la biología es la creencia de que los ácidos nucléicos tienen una capacidad inherente de instruir a su propia síntesis, y que los ácidos nucléicos no se pueden sintetizar en ausencia de una plantilla de ácido nucléico. Manfred Eigen y sus colegas en Alemania llevaron a cabo un extenso trabajo teórico y experimental sobre la autoreplicacion celular (139). Además de su genoma, utilizaron el virus bacterniano (fago) Qb. Además de su genoma, un molécula de ARN de cadena sencilla de 4.500 nucleótidos, el virus tiene una molécula de ARN de 220 nucleótidos conocido como "minivariante de Spiegelman" que, como el ARN genómico, se reproduce en sistemas de laboratorio de células libres mediante una enzima llamada Qb replicasa. Mediante la mezcla de iones Mg2+, los trifosfatos de nucleósidos ATP, GTP, UTP, CTP, Qb replicasa y ARN plantilla, podrían obtener replicación ARN, pero un hallazgo totalmente insospechado fue, incluso en la ausencia de la plantilla, el ARN se seguía sintetizando. Realizaron muchos experimentos para demostrar este fenómeno y para excluir la posibilidad de la presencia de un ARN plantilla inicial, y concluyeron: "Finalmente estuvimos convencidos de que teníamos ante nosotros moléculas de ARN que se habían sintetizado de novo mediante la enzima Qb replicasa. Lo que fue más desconcertante, el producto de novo tenía una composición uniforme que en cada ensayo resultó ser similar o incluso igual a la minivariante de Spiegelman". Cuando la mezcla libre de plantilla fue entonces dividida en varios departamentos aislados, en los que se mantuvieron las condiciones óptimas para la síntesis de novo, encontraron que "cada componente tenía una población uniforme del producto de novo, los productos diferían de compartimento a compartimento. Análisis posteriores revelaron sin embargo que las diferentes secuencias no estaban completamente relacionadas ... Hubo un producto final definido, uniforme para cualquier conjunto de condiciones experimentales, pero aquí existieron tantos productos óptimos diferentes así como diferentes condiciones experimentales. Uno de los productos óptimos parecía ser la minivariante de Spiegelman ... Otros productos de optimización se adaptaron a condiciones que destruirían los ARN's, tales como altas concentraciones de ribonucleasa, una enzima que separa el ARN en pedazos ... Algunas variantes fueron tan bien adaptadas a ambientes extraños que tuvieron una eficiencia de replicación de tanto como 1.000 veces mayor que la de variantes adaptadas a un entorno normal ... Cualquier ARN formado por química no instruida se reproduciría mediante química instruida de plantilla a una velocidad proporcional a la concentración de ARN actual. El resultado sería un crecimiento exponencial. Además, incluso si solamente una plantilla única se formara inicialmente mediante síntesis no instruida, habría pronto una gran cantidad de secuencias distintas, porque los errores (mutaciones, inserciones y eliminaciones puntuales) se realizarían inevitablemente en el curso de la replicación. Por lo tanto, en cada generación, no habría solamente un mayor número de cadenas de ARN, sino también una mayor variedad de secuencias de ARN. ¿Qué pasaría entonces?. Algunos de los mutantes se copiarían más rápidamente que otros, serían menos susceptibles a errores en la copia, y su concentración se incrementaría más rápidamente. Más tarde o más temprano, estos mutantes de crecimiento más rápido tomarían el control ... Por tanto, los resultados de la competición de autoreplicación tenían que ser la secuencia principal, junto con un enorme enjambre de mutantes derivados de ella y de la que no tenía forma de escapar ... Llamamos a esta distribución de mutantes completa una cuasiespecie. La distribución de mutantes cuasiespecies es la que sobrevive la competición entre ARN's autoreplicantes, y no solamente una secuencia maestra o varias otras equivalentes que son los genes más fuertes en la distribución. La esencia de su selección es la estabilidad de las cuasiespecies" (140). Según Eigen y sus colegas, la longitud máxima de una secuencia maestra de ARN es del orden de los 10.000 nucleóticos (139, 141).

6.3.7 Un principio básico de la biología molecuar es que la secuencia primaria de ADN refleja fielmente la secuencia primaria del ADN de la que se transcribe. Sin embargo, en la edición de ARN de los años 80 se descubrió que era "definido ampliamente como un proceso que cambia las secuencias de nucleótidos de una molécula de ARN de la ADN plantilla que la codifica". "En el proceso se puede readaptar una transcripción no funcional, produciendo un ARNm traducible, o modificando un ARNm que ya funciona, de manera que genera una proteína de secuencias de aminoácidos alteradas. Algunas veces la edición es tan extensa que la mayoría de secuencias en un ARNm no están codificadas genómicamente, sino que que se generan de modo post-transcripcional, produciendo la "paradójica situación de una transcripción que carece de la suficiente complementariedad para hibridar a su propio gen" (142-144). Según Nancy Maizels y Alan Weiner, del Department of Molecular Biophysics and Biochemistry at Yale University, "el dogma central ha sobrevivido a tiempos difíciles. El descubrimiento de la transcriptasa inversa alteró pero no violó el dogma central de como los genes producen proteínas; los intrones matizaron la conclusión de que los genes son necesariamente colineales con las proteínas que codifican: el reordenamiento de ADN de linfocitos puso en duda la estabilidad de los genomas eucarióticos, y el ARN catalítico desafió la preeminencia de las proteínas y dio nueva vida al mundo antiguo del ARN". Sin embargo, el descubrimiento la edición de ARN "podría estar cerca de asestarle un golpe mortal" (145).


6.3.8 Conclusión

El hallazgo de un fragmento nuevo de ARN o ADN y proteínas en:
(a) linfocitos de individuos enfermos o individuos que han sido "impactados" con agentes tales como los mitógenos físicos o químicos, agentes carcinógenos o agentes oxidantes en general como es el caso con pacientes de sida y aquellos en riesgo (77,79,90);
(b) linfocitos en cultivos o cocultivos (que podría conducir a la aparición de híbridos) que han sido "impactados" adicionalmente con, algunas veces, agentes múltiples similares;
no es una prueba de que el fragmento de ARN provenga del exterior, con independencia de su longitud, la presencia de poli-A y el número de ORF ("genes").

A partir de los datos de Montagnier, Gallo, Levy y sus colegas no es posible concluir que los "ARN's de VIH" que encontraron son "nuevas especies" de ARN's inducidas por el "impacto" de las células, o por uno o más de los otros fenómenos que salieron a la luz en los años 80. Ni es posible concluir que sus ARN's son el genoma de un retrovirus exógeno como hicieron. Sin embargo, se pueden hacer ciertas predicciones:
(a) si el "ADN del VIH" es en verdad el genoma de un retrovirus exógeno, entonces: (i) deben existir datos que prueben la existencia de una entidad molecular única "ARN del VIH", y un fragmento correspondiente de ADN ("ADN del VIH"), que tiene una longitud singular y unas secuencias de ácidos nucléicos singulares; (ii) cuando el fragmento de longitud completa de "ADN del VIH" o "ADNc del VIH" se utiliza para estudios de hibridación, todas las personas infectadas deben dar un resultado positivo.
(b) si el ARN seleccionado que se concentraba en la banda de 1,16 g/ml, el "ARN del VIH", es el genoma de un retrovirus que existe "en todos nosotros", retrovirus endógeno, entonces de nuevo los datos deben probar la existencia de una entidad molecular única, "ARN del VIH" ("ADN del VIH"). Cuando se realizan estudios de hibridación utilizando la longitud total de la entidad molecular singular como sonda, se deberían encontrar resultados positivos "en todos nosotros";
(c) si el ARN encontrado por los tres grupos, el "ARN del VIH", es el genoma de un retrovirus ensamblado de novo a partir de ADN ya existente en las células, como el resultado de condiciones in vivo o in vitro, los datos también deben probar la existencia de una entidad molecular única. Cuando la longitud total del fragmento único de ácidos nucléicos se utiliza como una sonda de hibridación, se debería encontrar un resultado positivo solamente en las células que se someten a exactamente las mismas condiciones in vivo o in vitro que aquellas de las cuales se obtuvo el "ARN del VIH" a 1,16 g/ml. Cuando solamente se utilizan fragmentos de "ARN del VIH"para la hibridación, la probabilidad de encontrar un resultado positivo aumentará;
(d) si el "ARN del VIH" es una especie molecular no viral singular de ARN resultante de la transcripción de una especie molecular singular de ADN, entonces cuando el fragmento completo de "ARN del VIH" ("ADNc del VIH") se utiliza como sonda para estudios de hibridación, se debería encontrar un resultado positivo solamente en las células del mismo tipo a aquellas de donde se originó el "ARN del VIH", en todos los individuos;
(e) si el "ARN del VIH" no es ni el genoma de un retrovirus ni una transcripción fiel de un fragmento de ADN presente en todas las células de donde se ha obtenido, sino que es el resultado del "impacto" al que las células han sido expuestas, in vivo, in vitro o de ambas formas, o como resultado de los fenómenos descubiertos en los años 80, entonces: (i) puesto que no es posible reproducir exactamente las condiciones in vivo o in vitro a las cuales las celulas se sometieron, resultaría difícil, si no imposible, obtener siempre una entidad molecular singular "ARN del VIH", es decir, obtener siempre un fragmento de ARN o de ADN de idéntica longitud y secuencias; (ii) cuando los fragmentos de longitud completa de "ARN del VIH" o de "ADNc de VIH" se utilizan como sondas de hibridación, habrá solamente una baja probabilidad de encontrar un resultado positivo. Sin embargo, la probabilidad aumentará si se emplean solamente pequeños fragmentos del "ARN del VIH" o del "ADNc del VIH".


6.4 Datos de que el "ARN del VIH" pertenece a un retrovirus exógeno

Los grupos de Montagnier, Gallo y Levy afirmaron que el ARN especial que seleccionaron a partir del ARN total que en gradientes de densidad de sacarosa se concentra en la banda de densidad de 1,16 g/ml, fue nuevo a los linfocitos y que, de hecho, pertenecía de un retrovirus exógeno. Aunque no presentaron datos para demostrar esta afirmación, no se puede descartar la posibilidad de que, efectivamente, este haya sido el caso. Puesto que, en la actualidad, su afirmación se acepta generalmente, uno habría pensado que a estas alturas ellos u otros investigadores deberían haber sido capaces de proprocionar claras pruebas confirmatorias. Esto no parece ser el caso.

6.4.1 Si el ARN se origina a partir de un retrovirus, bien sea exógeno o endógeno, entonces deben existir datos que prueben que tal ARN es un constituyente de partículas que poseen, al menos, las más básicas características morfológicas y físicas de los retrovirus, es decir " un diámetro de 100 a 120 nm gemando de las membranas celulares. Los viriones liberados de las células contienen cuerpos internos condensados (núcleos), y están salpicados de protuberancias (puntas, botones)" (82). Hasta la fecha nadie ha demostrado que el "ARN del VIH" pertenezca a tales partículas, no habiendo ni siquiera pruebas de que partículas de cualquier tipo estén presentes en el material procedente de los cultivos-cocultivos celulares que se concentra a la densidad retroviral de 1,16 g/ml, y de donde se selecciona el "ARN del VIH". Además, aunque se han mostrado partículas en los cultivos, los cultivos contienen muchos tipos distintos de partículas, pero ninguna muestra DOS principales características morfológicas, es decir, "un diámetro de 100-120 nm" Y superficies que "están salpicadas de protuberancias (puntas, botones)" (146).

6.4.2 Si el "ARN del VIH es el genoma de un retrovirus exógeno entonces, como los "retrovirus animales exógenos", deberíamos ser capaces de encontrarlo en material infectado sin la necesidad de volver al uso de cocultivación o de cultivos estimulados mitogénicamente. Sin embargo, ninguno de los fenómenos que se piensan que prueban la existencia del VIH se pueden detectar a menos que se empleen mitógenos, cocultivos o ambos (y a veces un "schock" adicional), un hecho aceptado tanto por Montagnier como por Gallo (78, 147).

6.4.3 No se puede afirmar que el "ARN del VIH" es el genoma de un retrovirus singular, el VIH, a menos que se tengan pruebas de que el "VIH" es una entidad molecular singular. Hacia 1985 se sabía que "los genes env del ARV y el HTLV-III difieren en más del 20%" y que "el grupo de Gallo ha secuenciado otro aislamiento HTLV-III y encuentra que difiere del primero tanto como el del ARC" (114, 148). En 1986, Gallo y sus colegas aceptaron que el "genoma del VIH" tiene una "variabilidad mucho mayor" en "comparación con el HTLV" y, de hecho, "La tasa de cambio genético del virus del sida es más de un millón de veces mayor que para la mayoría de los genomas de ADN, y podría ser incluso diez veces mayor que para algunos otros virus de ARN, incluyendo ciertos retrovirus y el virus de la gripe A" (149). En la actualidad se acepta que "no hay dos aislamientos idénticos. Cada aislamiento contiene muchas variantes" (150). En un mismo paciente los datos genómicos en monocitos difieren de los de en linfocitos T (151). Existen "diferencias notables" entre el ADN y ADNc proviral en una misma muestra de PBMC, "que no podrían explicarse por un artefacto de eficiencia de transcriptasa inversa ni por un sesgo de selección de plantilla" (152). Los datos genéticos obtenidos in vitro no correlan con los datos obtenidos en vivo, "cultivar es perturbar" (153). Según los investigadores del Instituto Pasteur, "un paciente asintomático puede albergar al menos 106 variantes genéticamente distintas del VIH, y para un paciente de sida la cifra es de más de 108" (154, 155). El "genoma de VIH" varía con el tiempo; en un caso en que se obtuvieron clones con 16 meses de diferencia, todos los clones detectados en la segunda muestra fueron distintos de los clones en la primera muestra (156). También se acepta que hasta un 99,9% de los "genomas del VIH" podrían ser defectuosos (157).

De acuerdo con Levy, "El mecanismo responsable de la generación estas distintas cepas de viriones es desconcertante. Una posibilidad teórica es que las copias provirales no integradas de VIH que se acumulan durante la infección replicativa aguda pueden experimentar una recombinación genómica eficiente, que conduce a la evolución de variantes infecciosas (158). En opinión de Robin Weiss, "la fuente de la variación es la infidelidad de la retrotranscripción, la cual no tiene un mecanismo de edición de errores transcripcionales", así como la "recombinación genética", especialmente cuando tiene lugar la fusión celular (159). A fines de los 80, investigadores del Instituto Pasteur concluyeron que "cada vez es más claro que será muy difícil describir correctamente las características de los virus de VIH utilizando simples clones moleculares". "Es evidente que el VIH, tanto in vivo como in vitro, es extraordinariamente complejo, y que se debe utilizar un enfoque basado en poblaciones, un enfoque de cuasiespecies según lo define Eigen, para describir el VIH. También añadieron: incluso con un enfoque basado en la población, solamente se pueden estudiar pequeñas regiones del genoma del VIH ... Dada tal complejidad y las diferencias evidentes entre cuasiespecies in vivo y in vitro, la labor de definir la infección de VIH en términos moleculares será difícil" (153, 160). Los datos que se han publicado desde entonces confirman su conclusión. Antes de la década de los 90, las secuencias del VIH se clasificaron como de África y Estados Unidos-Europa, con diferencias de secuencia de 20 a 30 % entre estos dos grupos (161). En los años 90, investigadores del VIH comenzaron a dividir el "genoma del VIH" en los subtipos A, B, C, D, E, etc. La base de este sistema de clasificación es:
"(a) los subtipos son aproximadamente equidistantes uno del otro en env (una filogenia 'estrella');
(b) el árbol filogenético env es en su mayor parte congruente con los árboles filogenéticos gag;
(c) se requiren dos o más muestras para definir un subtipo de secuencia".
Sin embargo, "han surgido problemas de nomenclatura de subtipo por varias razones. Un número pequeño pero no insignificante de secuencias virales son híbridas, agrupándose con un subtipo de secuencia en gag y con otro subtipo de secuencia en env, por ejemplo; o por poner otro ejemplo, la agrupación en diferentes tramos con dos o más subtipos en env ... La denominación se convierte en un problema cuando aparecen formas altamente divergentes de un determinado subtipo: estas formas a veces se denominan como A', B', C' etc. Es cada vez más necesario disponer de datos de secuencia tanto de la secuencia de codificación gag como de la env, cuando se reclama una nueva forma o subtipo" (162). A mediados de este año se describieron "al menos diez" genotipos de VIH-1, O, prevalentes principales (A-J) y uno de baja prevalencia (M), y se sigue informando de nuevos genotipos (8, 163). Según investigadores del Henry M Jackson Foundation Research Laboratory and Division of Retrovirology, Walter Reed Army Institute, USA, "La gran mayoría de los envíos genotípicos del VIH-1 se basan en segmentos de secuencia subgenómicos, abarcando por lo general del 2% al 30% del genoma", y no por las comparaciones del genoma completo. Esto es debido a que "sigue siendo poco práctico obtener secuencias genómicas de longitud completa de aislamientos del VIH-1 como metodo rutinario de genotificación, debido a la baja abundancia de ADN proviral del VIH-1 en muestras clínicas y cultivos de virus en sustrato PBMC, y a la ineficiencia relativa de la reacción en cadena de la polimerasa cuando los amplicones se hacen grandes". "La designación de Virus de Inmunodeficiencia Humana Tipo 1 (VIH-1) abarca una complejidad no prevista de formas virales" (163). Según investigadores de Los Alamos National Laboratory, "mientras que una designación de subtipo basada en un gen o fragmento de gen podría ser correcta, podría haber ocurrido una recombinación. Por tanto, debe tenerse cuidado para no sobreinterpretar la designación del subtipo. Si se va a analizar la designación de subtipo de los aislamientos virales basados en los datos presentados aquí, deberían referirse a la designación como 'tipo B sobre region de bucle V3' y no como 'subtipo-B'" (164). Una misma persona podría estar "infectada" con más de un subtipo (165). Esto significa que, en la actualidad, no es posible decir cuáles son las diferencias de secuencia, tanto cualitativas como cuantitativas, entre los distintos subtipos del VIH-1. Sin embargo, existen algunos datos. En 1993, investigadores de algunas instituciones "reportaron que en los genotipos A-G del VIH-1, las distancias intragenotípicas de gag promediaban un 7%, mientras que las distancias intergenotípicas promediaban un 14% ... El nivel máximo de variabilidad en gag esta todavía muy por debajo de la observada para la región de cubierta del VIH-1" (166). "Dos cepas del VIH-1, designadas como ANT70 y MVP5180, se aislaron en 1987 y 1991 respectivamente de pacientes en Camerún". Se clasificaron como VIH-1 subtipo O. En 1994 se presentaron datos que "indicaron que el subtipo O era endémico en Camerún y Gabón" (167). " El análisis de secuencia de ADN de MVP-5180 mostró que su organización genética era la del VIH-1, con un 65% de similitud con las secuencias de consenso del VIH-1 y un 56% de similitud con las del VIH-2. El gen env de MVP-5180 tuvo similitudes con el VIH-1 y el VIH-2 de 53% y 49% respectivamente ... La comparación de la secuencia de aminoácidos del MVP-5180 con la del virus de chimpancé de Gabón mostró similitudes del 70%, 78% y 53% en los genes gag, pol y env, respectivamente; se encontraron similitudes del 70, 76 y 51% al VIH-1 de Uganda (U455) y de 54, 57 y 34% al aislamiento D205 del VIH-2". Los investigadores de Alemania y Camerún que realizaron este estudio expresaron la opinión de que "podrían existir incluso VIH's más divergentes. Tales VIH's divergentes es probable que se transmitan por las vías habituales (contacto sexual y por sangre y transmisión madre a hijo), dando lugar a una distribución más amplia. Deberán ser tenidas en cuenta en el desarrollo de vacunas y en la sensibilidad y especificidad del test de diagnóscito" (168). Ciertamente, este parece ser el caso. El año pasado, David Ho y sus colegas (169) estudiaron un paciente australiano con "infección primaria". "Puesto que los seroconversores generalmente albergan una pooblación relativamente homogénea de virus", se sorprendieron cuando encontraron que estaba "coinfectado" "con VIH-1 de subtipo B múltiple ... Las distancias genéticas promedio entre los grupos I y II, I y III, y II y III fueron 9,6 %, 16,5% y 18,4% respectivamente ...Una población de secuencias fue claramente distinguible de las otras sobre la base de un análisis filogenético. Además, también se encontraron secuencias sugiriendo recombinación entre dos de las tres distintas poblaciones virales".

El que el "ADN del VIH" podría ser "incluso más divergente" de lo que ha sido generalmente aceptado se ilustra mejor en un estudio publicado este año por investigadores de los Estados Unidos. Debido a que los inhibidores de proteasa se están convirtiendo en las drogas de elección para el tratamiento de los individuos "infectados con VIH", y puesto que "las mutaciones que ocurren de modo natural en los pacientes infectados con VIH-1 tienen importantes implicaciones para el tratamiento y el resultado de los estudios clínicos", estos investigadores realizaron un "análisis de secuencia del gen pr [gen de proteasa] en 167 cepas virales de VIH-1 de 102 pacientes sin tratamiento previo con inhibidores de proteasa procedentes de distintas regiones de los Estados Unidos". "Dado el tamaño relativamente pequeño de la enzima y las limitaciones en su estructura impuestas por la funcion, fue razonable concluir que la variabilidad de secuencia del VIH-1 estaría limitada". Para su sorpresa, entontraron que "un total de 41% de los nucleóticos y un 49,5% (49/99) de los aminoácidos fueron variables. La diversidad de aminoácidos vista en estos aislamientos virales americanos es mucho mayor que la reportada previamente para los virus tipo B del VIH-1", y es también mayor que la vista en los genes pr para todos los tipos de VIH-1 (40 de 99, 40% de los aminoácidos variando" (170). En la actualidad, más alla de en 1986, cuando Gallo y sus colegas llegaron a su conclusión de que "La velocidad de los cambios genéticos para el virus del sida es más de un millon de veces mayor que para la mayoría de los genomas de ADN, y podría ser incluso diez veces mayor que para algunos otros virus de ARN, incluidos ciertos retrovirus y el virus de la gripe A", y en 1989 cuando los investigadores de Pasteur llegaron a su conclusión de que "la tarea de definir la infección de VIH en términos moleculares será difícil", no hay datos que prueben la existencia de una entidad molecular singular "ARN del VIH" ("ADN del VIH"). De hecho, hay bastantes razones por las que las innumerables e inconmensurables "ADN's del VIH"no se pueden ni siquiera describir "en términos de poblaciones de genomas estrechamente relacionados, referido como una cuasiespecie" (153). Estas incluyen:
(a) Eigen y sus colegas desarrollaron el modelo de cuasiespecies para describir la distribución de ARN's autorreplicantes. Sin embargo, se dice que el "ARN del VIH" que no es un ARN autoreplicante, sino que se replica a través de un ADN intermediario;
(b) el ARN autoreplicante de los virus de ARN parece "demostrar una estabilidad notable en algunas situaciones. La vacuna del poliovirus de Sabin tipo 3 difiere de su progenitor neurovirulento en solamente 10 posiciones de nucleótidos, después de 53 pasajes in vitro y 21 in vivo en tejidos de monos. En 1977, el virus de la gripe A H1N1 reapareció en la población humana tras 27 años de inactividad con secuencias principalmente idénticas a las del virus de la década de los 50". Aunque el modelo de cuasiespecies de Eigen se ha utiilizado para describir el genoma de los virus de ARN, incluso el 1% de las diferencias de secuencia en estos genomas se considera que representan "variabilidad extrema". "Muchas fuerzas selectivas pueden estabilizar las poblaciones de virus. Estos factores estabilizadores podrían incluir la necesidad de conservación de la estructura y función de proteínas, la estructura secundaria de ARN, sitios de glicosilación, y sitios de fosforilación. Incluso los cambios de codon tercero puede estar sujeto a presiones selectivas. Recientemente, se ha observado una conservación notable de ciertas secuencias de dominios de proteínas entre virus de ARN sin relación alguna (171). ¿Es posible describir el "ADN del VIH" incluso si tiene una variación del 10%, por no hablar del 20 o 30 o 40% como es el caso, como una "población de genomas estrechamente relacionados, referida como una cuasiespecie"?;
(c) Al definir el concepto de una cuasiespecie Eigen escribió: "En el estado de equilibrio que es finalmente alcanzado por el mejor competidor, denominado secuencia maestra m, coexiste con todas las secuencias mutantes derivadas de ella mediante copia errónea. Designamos esta distribución de secuencias como cuasiespecies". Sin embargo, hasta la fecha nadie ha probado que:
(i) exista una cuasiespecie del "VIH" que esté alguna vez en equilibrio;
(ii) los "genomas del VIH estrechamente relacionados" se deriven de una secuencia maestra;
(iii) haya existido alguna vez una secuencia maestra.

6.4.4 Si el tramo de "ARN del VIH" es el genoma de un virus exógeno que infecta a individuos con sida o a aquellos en riesgo, entonces este ARN (o ADNc) debería estar presente en tejido fresco no cultivado de todas estas personas, y en nadie más. Además, si en estos individuos hay una infección masiva de VIH, como afirman algunos de los mejores expertos del VIH (172, 173), la hibridación Southern blot debería ser más que suficiente para detectarlo. El primero de estos estudios se llevó a cabo por Gallo y sus colegas en 1984. Utilizando una técnica de hibridación Southern blot testearon muchos tejidos de pacientes de sida, incluidos ganglios linfáticos. Resumiendo su investigación escribieron: "Habíamos sido capaces previamente de aislar el HTLV-III de sangre periférica o tejido de ganglio linfático de la mayoría de los pacientes con sida o ARC" (lo "aislaron" de aproximadamente el 50% de los pacientes referidos por Gallo). "Sin embargo, como se muestra aquí, el ADN del HTLV-III no suele ser detectado por la hibridación Southern Blotting estándar de estos mismos tejidos, y cuando sí es detectado, las bandas son a menudo débiles ... el agrandamiento de los ganglios linfáticos que se encuentra comunmente en pacientes de ARC y sida no puede deberse directamente a la proliferación de células infectadas con el HTLV-III ... la ausencia de secuencias detectables de HTLV-III en tejido de sarcoma de Kaposi de los pacientes de sida sugiere que este tumor no está causado directamente por la infección de cada célula de tumor con el HTLV-III ... la observación de que las secuencias de HTLV-III se encuentran raramente, si alguna vez, en células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, y bazo proporciona los primeros datos directos de que estos tejidos no están en gran medida o ampliamente infectados con el HTLV-III ni en pacientes de sida ni de ARC" (96). Estos estudios fueron confirmados por muchos otros investigadores. El hallazgo de que cuando los resultados eran positivos las bandas de hibridación eran "débiles" o "de baja señal" se interpretó como prueba de que los individuos seropositivos al VIH contienen ADN del VIH en un número pequeño de células y en un número pequeño de copias, una interpretación que llegó a ser generalmente aceptada, aunque Gallo y sus colegas tenían una explicación alternativa: "Teóricamente, esta baja intensidad de señal podría explicarse también por la presencia de virus poco homólogo con el HTLV-III en estas células" (96). Esta explicación alternativa ha sido ignorada por todos, incluido Gallo. Sin embargo, en una reunión de 1994 celebrada en Washington, patrocinada por el US National Institute of Drug Abuse, Gallo admitió: "Nunca hemos encontrado el ADN del VIH el las células tumorales del KS ... De hecho nunca hemos encontrado el ADN del VIH en células T (174). Los datos que han salido a la luz desde 1984 sugieren que la explicación alternativa de Gallo y sus colegas podría ser un hecho:
(a) en la actualidad hay muchos datos que muestran que el ADN humano normal contiene secuencias relacionadas con el HTLV-I y el HTLV-II (ver 6.3.2);
(b) al parecer, hasta 1993, Gallo no tenía conocimiento de la existencia de retrovirus humanos endógenos (107), lo que significa que por "virus poco homólogo al HTLV-III" podrían haber querido decir nada más que retrovirus exógenos que Gallo afirmó haber descubierto antes, es decir, el HTLV-I y el HTLV-II. Sin embargo, en la actualidad Gallo admite que las secuencias provirales endógenas humanas "comprenden aproximadamente el uno por ciento del genoma humano";
(c) algunos de los expertos más reconocidos del VIH, incluyendo a Montagnier, Blattner y Gelderblom, están de acuerdo en que los genes pol y gag "podrían estar muy conservador entre subtipos de virus" (ver 5.6). En un artículo publicado en 1996 por Reinhart Kurth y sus colegas se puede leer: "Los retrotransposones evolucionaron en una variedad de organismos que van desde los protozoos hasta los seres humanos. En estos elementos, los genes de RT están enlazados a genes que codifican poliproteínas, con el potencial de autoagregar y formar partículas de núcleo. Estas partículas son los equivalentes de las proteínas de la cáspide retroviral, generalmente designadas como antígenos específicos de grupo (gag) ... Estos [los retrotransposones] podrían ser bien los derivados o los predecesores de los retrovirus. Los retrovirus difieren de los retrotransposones por la presencia de al menos una región de codificación adicional, el gen de cubierta (env)" (175). En 1984, el grupo de Gallo informó que el "genoma del VIH" hibridó con "los genes estructurales (gag, pol y env) de tanto el HTLV-I como el HTLV-II (56). Obviamente, el encontrar una "señal" de hibridación positiva, al menos con una sonda gag o pol del "VIH", no es prueba de la existencia del "genoma del VIH"; de hecho, en la actualidad también existen datos que muestran que la presencia de secuencias de "VIH" en tejidos no infectados:
(i) aunque no se acepta por más tiempo que el VIH se transmite o está presente en insectos, en 1986 investigadores del Instituto Pasteur encontraron secuencias de ADN del VIH en moscas tse-tse, escarabajos negros y en leones de hormigas de Zaire y la República Centroafricana (176);
(ii) en 1985 Weiss y sus colegas reportaron el aislamiento, a partir de cultivos de células T estimulados mitogénicamente de dos pacientes con hipogammaglobulinemia variable común, un retrovirus que "estaba claramente relacionado con el HTLV-III/LAV"; Los datos incluyeron un WB positivo con sueros de sida e hibridación con sondas de VIH (177);
(iii) el ADN extraído de las glándulas tiroides de pacientes con la enfermedad de Grave hibrida con "la región de codificación p24 gag completa" del VIH (178);
(iv) en un estudio diseñado para hacer frente a la cuestión de si las células neuronales de los pacientes con complejo de demencia del sida están infectadas con el VIH, "los cerebros de 10 pacientes con sida y los datos neurológicos de encefalitis viral, y los cerebros de 5 pacientes sin infección VIH-1" se examinaron utilizando una sonda gag del VIH. "La ribosonda antisentido hibridó a células que se sabe que están infectadas con el VIH-1. Se hibridó con células A3.O1 infectadas con el VIH-1, así como con linfocitos esplénicos y renales obtenidos de autopsias de pacientes que se sabe que tienen sida. La sonda, sin embargo, no hibridó a las neuronas en las secciones del cerebro de 10 pacientes con sida ... Sorprendentemente, cuando aplicamos el sentido de control de la sonda gag del VIH a las secciones del cerebro de pacientes con sida, observamos una hibridación específica a las células neuronales. Del mismo modo, cuando se examinaron las secciones del cerebro de cinco individuos no infectados con el VIH-1, la sonda de sentido del VIH-1 detectó transcripciones en células neuronales. Nuestro análisis Northern blot confirmó estos resultados y demostraron la presencia de una transcripción poliadenilada de 9,0 kb en los tejidos cerebrales" (179). De este modo, cualquiera de las señales de hibridación positivas obtenidas con la sonda antisentido no son específicas del VIH, o como los autores concluyeron, hay una transcripción de 9,0 kb específica de neurona que muestra una extensa homología con secuencias gag VIH-1 antisentido, y que esta transcripción se expresa en células neuronales de tanto individuos infectados con el VIH-1 como no infectados;
(v) Horowitz et al "describen el primer informe de la presencia de secuencias de nucleótidos relacionados con el VIH-1 en los ADN's de humanos, chimpancés y monos Rhesus de individuos normales no infectados". "Demostraron la presencia de una familia compleja de secuencias relacionadas con el VIH-1" en las especies anteriores, y concluyeron que "un análisis adicional de los miembros de esta familia ayudará a determinar si tales secuencias endógenas contribuyeron a la evolución del VIH-1 mediante eventos de recombinación, o si estos elementos, bien directamente o a través de productos de proteína, influyen la patogénesis del VIH" (180).
La conclusión inevitable es, por tanto, que los estudios de hibridación no prueban que las células T, o cualquier otras células de pacientes de sida o aquellos en riesgo, contengan una entidad molecular singular "ADN del VIH". 6.4.5 En la segunda mitad de los años 80, con el fin de rescatar el concepto de un "genoma del VIH", los expertos del VIH hicieron un amplio uso de un nuevo proceso descubierto conocido como reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Aunque la PCR es una herramienta muy útil en biología molecular, hay muchos problemas asociados con su uso en el estudio del "genoma del VIH":
(a) la PCR es una técnica extremadamente sensible. Al escribir acerca de su descubrimiento ganador del premio Nobel, el propio Kary Mullis, irónicamente escéptico de la hipótesis VIH-sida escribió: "A partir de una sola molécula la PCR puede generar 100 billones de moléculas similares en una tarde" (181). Con tal amplificación no es difícil detectar incluso muy bajos niveles del "genoma del VIH". Sin embargo, "una característica notable de los resultados obtenidos" en 1990 con la PCR así como con la hibridación Southern-Northern estándar fue "la escasez o ausencia aparente de ADN viral en una proporción de pacientes" (182). En un esfuerzo adicional de rescatar el "genoma del VIH", en los años 90 investigadores del Department of Genetics University of Edinburgh introdujeron una versión modificada de la PCR, el método de PCR doble o PCR anidada. "La PCR doble soluciona el problema de la amplificación limitada de secuencias de plantilla raras". Reportaron que "Utilizando una reacción en cadena de la polimerasa doble que permite detectar una única molécula de provirus y un método de cuentificación de las moléculas de provirus, hemos medido frecuencias de provirus en individuos infectados a un nivel de una molécula por 105 PBMC's ... Como regla general, solamente una pequeña proporción de PBMC contiene provirus (valor de la mediana de las muestras de 12 pacientes, uno por cada 8.000 células) ... muestras de 7 de nuestros 12 pacientes (60%) contuvieron uno o más provirus por cada 80.000 células". Concluyeron: "El rasgo más llamativo de los resultados es el nivel extremadamente bajo de provirus de VIH presente en PBMC circulantes, en la mayoría de los casos" (182). No hay duda de que la PCR puede "amplificar una aguja de ADN en un pajar de ADN", pero incluso la PCR no puede hacer milagros.

En una reseña del libro de Neville Hodgkinson, "sida, el fracaso de la ciencia contemporánea: como un virus que no existe engañó al mundo" (183), Sir John Maddox escribió: "el virus que nunca fue se ha hecho más tangible" a principios de 1995 cuando "se puso de manifiesto que, incluso en las primeras etapas de la infección por el VIH, el virus está lejos de ser latente" (184). Maddox se refiere a dos artículos publicados en la revista Nature en 1995. Uno por Ho et al, donde los autores afirmaron haber mostrado que, en pacientes que no han recibido tratamiento antiviral, los "niveles virales en plasma oscilaron entre ... 15 X 103 hasta 554 X 103 viriones por ml" (172); el otro por Wei et al donde se afirma que "los niveles de ARN viral de plasma en los 22 sujetos en la linea de base variaron de 104,6 a 107,2 moléculas por ml", y concluyeron que su estudio "sugiere que la expresión de virus de por sí está directamente implicada en la destrucción de células CD4+. Los datos no sugieren un "inocente" mecanismo de observador de muerte celular, por el cual las células no infectadas o con infección latente se dirigen indirectamente a la destrucción mediante absorción de proteínas virales o mediante reactividades autoinmunes" (173). Estas afirmaciones plantean dos preguntas obvias:
(i) "La mayoría de los pirógenos exógenos son microorganismos, sus productos o toxinas", y "los pirógenos endógenos son polipéptidos producidos por una gran variedad de células huésped nucleadas, incluyendo monocitos/macrófagos y los "linfocitos, células endoteliales, hepatocitos, células epiteliales, queratinocitos y fibroblastos, así como otras células ... generalmente en respuesta a los estímulos de iniciación desencadenados por infección o inflamación" Además, "muchos productos endógenos dan lugar a la liberación de pirógenos endógenos, provocando de este modo la fiebre. Tales sustancias endógenas incluyen complejos de antígeno-anticuerpo, complejos con complemento, productos de escisión de complemento, metabolitos de hormonas esteroides, ácidos biliares y algunas citoquinas" (185). Puesto que "el virus ["VIH"] se está replicando 24 horas al día desde el día uno" (155) y "células 2X109 CD4+ se producen y destruyen cada día", y la fiebre y "muchas de las características asociadas a la fiebre se pueden reproducir mediante infusiones de citoquinas purificadas, incluyendo el dolor de espalda, mialgias generalizadas, atralgias, anorexia y somnolencia" (185), es realmente sorprendente que tal infección "masiva" y destrucción celular pueda permanecer en gran parte, si no totalmente, asintomática durante periodos prolongados de tiempo en individuos seropositivos al VIH;
(ii) Si hay tal infección de VIH "masiva", ¿por qué no es detectada por procedimientos de hibridación estándar, y por qué, a fin de detectar tal infección "masiva", los autores no utilizaron la PCR que puede "amplificar una aguja de ADN en un pajar de ADN", o incluso la PCR anidada, sino que fueron obligados a determinar el "ARN viral" con nuevos ensayos, "modificando el ADN ramificado (ADNb) o el ensayo RT-PCR y confirmado mediante QC-PCR" para la cual no se dieron detalles?

Uno de los muchos problemas (186, 187) asociados con los estudios de Ho y Wei y los métodos que emplean se ilustra en una presentación en la XI Conferencia Internacional sobre el sida. Investigadores del Medical School, Camden, New Jersey, tomaron una sola muestra de plasma de un paciente "con una cuenta de CD4 de 123 celulas/cmm" y la dividieron en diez alícuotas. El ARN de cada muestra se retrotranscribió, y el ADNc "se amplificó entonces con un ADN de control interno (imitador) utilizando cebadores gag ... el ADNc también se acumuló a partir de las 10 reacciones de RT individuales y se realizó QC-PCR diez veces en el ADNc acumulado". Reportaron que "La media del número de copias de VIH-1 para las 10 alícuotas de plasma individuales fue de 136.000 copias/ml de ARN, con una desviación estándar de 76.9000 copias/ml (rango de 74.2000 copias/ml a 334.600 copias/ml). El número de copias de VIH-1 media para el ADNc acumulado ensayado 10 veces fue de 145.900 copias/ml con una desviación estándar de 61.900 copias/ml (rango de 84.500 copias/ml a 259.300 copias/ml) ... la RT no es la fuente de la variabilidad en el QC-PCR del VIH-1. Más bien, la variabilidad se debe probablemente a las diferencias de la amplificación de la plantilla objetivo y al control interno utilizado en el ensayo QC-PCR" (188).

Según Maddox y Wain-Hobson, tanto Ho como Wei y sus colegas fueron capaces de llegar a sus sorprendentes conclusiones solamente después de una década de investigación del VIH porque se asociaron con matemáticos, y porque fueron capaces de utilizar "Nuevas técnicas para el ensayo de los bajos niveles de virus involucrado" (cursiva nuestra). Resulta irónico entonces que la mayor crítica de estos estudios haya emanado de matemáticos como Frank Buianouckas, del Department of Mathematics and Computer Science, City University, Bronx, New York USA, y de Mark Craddock, School of Mathematics and Statistics, The University of Sydney, Australia. "¿Qué es esta viremia de billones de partículas de ARN que solamente puede verse con una PCR de rama indocumentada o PCR, pero no con un test de infectividad funcional?" (189). "Mi pregunta es la siguiente: qué es exactamente lo que tiene que pasar para que la gente que hace investigación del VIH se aleje de la alta tecnología, métodos no probados, especulaciones misteriosas sobre interacciones moleculares, etc etc, y se pregunte '¿alguno de nosotros tenemos la mínima idea de lo que estamos haciendo?'" (190). Alguien podría decir que las críticas de los artículos de Ho y Wei por parte de individuos de el movimiento disidente del VIH-sida no son inesperadas, pero es inaudito que un grupo de expertos del VIH critique a otro como ocurrió con los estudios Ho y Wei (191). En 1995, como resultado de ciertas "dudas" sobre las pretensiones de Ho, Wei y sus colegas, "dos docenas de investigadores del sida se congregaron en Berkeley, California, para desafiar el establecimiento, copias de permuta de sus propios manifiestos, y disfrutar de un rato agradable durante dos días con conpañeros pensadores "alternativos", quienes concluyeron que Ho et al y Wei et al "tuvieron pocas pruebas convincentes de que sus ideas fuesen correctas" (192).
(b) Según investigadores del Walter Reed Army Institute of Research, "el amplio uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para recuperar el ADN proviral del VIH-1 ha favorecido el análisis de los amplicones cortos que se recuperan de modo más eficiente con esta técnica" (193). De hecho, en la gran mayoría de los casos, la presencia del "genoma del VIH" se demuestra mediante la amplificación de cortas "regiones invariantes" de un "gen viral", normalmente en gen gag. Sin embargo, puesto que se acepta que una proporción signiticativa de los "genomas del VIH" son defectuosos, el encontrar un fragmento de un gen no es prueba de la existencia del gen completo, y menos aún de la existencia el genoma completo "ADN del VIH" o "ARN de VIH", un punto aceptado por muchos investigadores del VIH-sida.
(c) Si existe una entidad molecular singular "ADN del VIH", entonces los mismos cebadores deberían ser capaces de amplificarla, independientemente de donde se encuentre tal ADN singular. Según los mismos investigadores, "debido a la amplia diversidad genética del VIH-1, se limitan las oportunidades de identificar un par cebador único capaz de amplificar los diversos subtipos" (193, 194). De hecho, los resultados de amplificación obtenidos con cebadores para diferentes genes de un subtipo no concuerdan completamente. Por ejemplo, en la primera PCR del "VIH" se utilizaron dos pares de cebadores para amplificar el gen gag, encontrándose que "algunas muestras dieron positivo con solamente uno de los dos pares cebadores" (195). Se dice que en los Estados Unidos y Europa las personas se infectan casi exclusivamente con el subtipo B. Sin embargo, investigadores de la Universidad de Edimburgo encontraron que "Los resultados obtenidos con los cebadores gag y env no concordaban completamente. En 5 de los 28 duplicados, se amplificó bien una secuencia gag o una env, pero no ambas" (182). En un estudio de PCR de 40 individuos utilizando cebadores de las regiones LTR, gag y env, desarrollado por investigadores franceses, incluyendo investigadores del Instituto Pasteur, de 38 muestras positivas "34 fueron positivas a gag (90%), mientras que env y LTR se dectectaron en menos casos, 24 muestras (63%) y 18 muestras (47%) respectivamente ... 11 de 40 muestras fueron positivas con tres pares de cebador, 16 con dos pareces de cebador, y 11 con solamente un par de cebador" (196). Tales discrepancias pueden deberse a:
(i) "una reacción falso positivo", que los propios autores sugieren pero que dicen que es improbable;
(ii) "la variabilidad genómica conocida del VIH". Si este es el caso, entonces no se puede hablar del "genoma del VIH" como una entidad molecular singular. En efecto, si se toma en consideración tal variabilidad, entonces podría ser solamente la falta de una inmensa variedad de pares de cebadores que evita que todos los Homo Sapiens sean "infectados con el VIH".
(iii) el genoma es defectuoso.
(d) No se puede obtener información significativa de un test a menos que el test esté estandarizado y sea reproducible. No existen estos datos en la actualidad para la PCR. De hecho, puesto que hay tantos subtipos del "VIH" y hay que utilizar distintos cebadores para distintos subtipos, o incluso para el mismo subtipo, es extremadamente improbable que tales datos se puedan obtener alguna vez.
(e) Con mucho, el parámetro más importante de un test es su especificidad, es decir, con cuanta frecuencia el test es negativo cuando está ausente la condición buscada. Para la PCR se debe tener la prueba de que los cebadores:
(i) pertenecen a un retrovirus singular como se define en los procedimientos descritos en 6.1;
(ii) las secuencias de cebador se encuentran solamente en el retrovirus singular, y en ningún otro sitio;
No existe tales datos para los cebadores del "VIH". De hecho, puesto que no es posible decir cuáles son las secuencias de "ADN del VIH", se sigue que tampoco es posible ser específico acerca de lo que representan los cebadores. Incluso si se supone que el "ADN del VIH", y por tanto los cebadores, son específicos a un retrovirus, puesto que:
(a) la mayoría de los cebadores del "VIH" se originan de las líneas de células leucémicas HUT78 (H9), CEM, y las células transformadas EBV;
(b) existen datos que las células leucémicas y las células transformadas EBV contienen retrovirus endógenos, incluyendo la línea de células CEM (88);
(c) "la liberación de retrovirus endógenos puede estar causada por los métodos utilizados para "aislar el VIH";
(d) el propio Gallo reportó que la línea de células HUT78 (H9) "contuvo secuencias provirales del HTLV[-I]" (105);
(e) no existe ningún método para separar un retrovirus de otro;
Entonces es imposible decir que las sondas de "ADN del VIH" son VIH, o las sondas de ADN de un retrovirus endógeno, ni siquiera de un retrovirus exógeno HTLV-I;
(iii) en una muestra de ADN (ARN) los cebadores se unen solamente a las secuencias de VIH y no a cualesquiera otras secuencias no homólogas del VIH o no homólogas. De nuevo, no existen esos datos. Además, datos los hechos de que:
(a)"sobre el uno por ciento del genoma humano" consiste de secuencias retrovirales endógenas;
(b) existen homologías entre los genes de retrovirus exógenos y endógenos, especialmente en los genes gag y pol, y entre estos genes y los retroelementos celulares;
la unión específica de los cebadores del "VIH" es poco probable.

Incluso si (i)-(iii) estuviesen probados, aún se debe determinar la especificidad de la reacción PCR, es decir, mostrar que no se obtienen resultados positivos en individuos que no están infectados con el VIH. Esto solamente se puede determinar utilizando el aislamiento del VIH como un estándar oro independiente, es decir, mediante la comparación de la PCR con los procedimientos descritos (ver 6.1). Esto no se ha realizado, un hecho aceptado por uno de los investigadores del VIH-sida más conocidos, William Blattner: "Una dificultad para ensayar la especificidad y sensibilidad de los retrovirus humanos [incluyendo el VIH] es la ausencia de un 'estándar oro' definitivo" (59).
(f) En la actualidad, algunos datos obtenidos sin el uso del estándar oro muestran que el procedimiento de la PCR no es específico:
(i) Ha habido solamente un estudio en que se examinara la reproductibilidad, sensibilidad y especificidad de la PCR. En este estudio, el estándar oro utilizado no fue el aislamiento del VIH sino el estado serológico (Western blot del VIH). En esta investigación, Christine Defer del Laboratorie d'Ingenierie Moleculaire, Centre Regional de Transfusion Sanguine, incluyendo a colegas del instituto Pasteur, estudiaron la habilidad de la PCR en "Siete laboratorios franceses con gran experiencia en detección por PCR de ADN del VIH". Se pusieron a prueba cuatro grupos de personas: unos con "resultados de test positivo al VIH inequívoco" (ELISA confirmado con el Western blot); "individuos con bajo riesgo de infección por VIH que presentaron un anticuerpo anti-p24 persistente y aislado en el Western blot"; "individuos seronegavitos al VIH-1 (con ELISA) con un bajo riesgo de infección por VIH (donantes de sangre)"; y individuos seronegativos (con ELISA) con alto riesgo de infección por VIH (contactos homosexuales de una pareja seropositiva al VIH)". A partir de "dos paneles celulares mononucleares de sangre periférica distintos, cada uno consistente en 20 muestras", los autores compararon los resultados de PCR en los sujetos seropositivos y seronegativos. La PCR resultó no ser reproducible: "se observaron resultados falsos positivos y falsos negativos en todos los laboratorios (la concordancia con la serología varió del 40 al 100%), y el "número de resultados PCR positivos no difirió significativamente entre los seronegativos de alto y bajo riesgo" (197);
(ii) el encontrar una PCR positiva en los eosinófilos se ha interpretado como que "sugiere que los eosinófilos podrían actuar como células huesped para el VIH-1" (198). Sin embargo, eosinófilos fijados con formaldehído se unen no específicamente con sondas de ARN, a pesar de la digestión con enzimas proteolíticas y acetilación ... Cuando las preparaciones se tratan con cantidades adecuadas de ribonucleasa para destruir el ARN viral, la unión eosinofílica permanece" (199);
(iii) un grupo de investigadores reportó que "Mientras evaluaban un procedimiento de PCR anidado para la detección de VIH, se encontró que los cebadores para el gen env del VIH-1 amplifican secuencias de ADN satélite humanas en una pequeña proporción de donantes de sangre para producir un fragmento que se acerca en tamaño al fragmento de PCR de VIH genuino en genes teñidos en bromuro de etidio" (200);
(iv) Los controles e incluso los búferes y reactivos pueden dar señales positivas de PCR del VIH (201);
(v) "Los monocitos de pacientes VIH positivo en los que no se puede detectar ADN del VIH, ni siquiera con PCR, llegan a ser positivos al ARN del VIH tras el cocultivo con células T activadas por ConA normales" (202);
(vi) se acepta generalmente que una vez uno es infectado por el VIH, siempre se está infectado. Sin embargo, un positivo PCR vuelve a negativo cuando la exposición a los factores de riesgo se interrumpe (203).

En un estudio de 327 trabajadores de la salud expuestos al "virus de inmunodeficiencia humana" por lesiones por pinchazos, 4 tuvieron "uno o más tests PCR positivos". Otros 7 tuvieron "un resultado test PCR indeterminado en el especímen inicial". Muestras posteriores para los 11 fueron negativas, "ninguno seroconvirtió o desarrolló p24 antigenemia" y "todos los individuos permanecieron sanos" (204, 205). Si bien el que ocurra esto en adultos es esporádico, se ha reportado en niños con mucha más frecuencia. Sin embargo, la PCR no se utiliza como diagnóstico rutinario de la infección del VIH en adultos, y raramente, si alguna vez, se repite. A diferencia de los adultos, la PCR se utiliza con mucha frecuencia en niños, siendo este el caso ya que el "diagnóstico de VIH" es "complicado por la persistencia de anticuerpos maternos adquiridos pasivamente". En 1995 numerosos estudios en niños (206-209) revelaron la conversión de un PCR positivo a negativo. Uno de los informes más recientes se publicó en 1995 por investigadores franceses. En una cohorte de seis años de 188 niños "infectados", que fue analizada de modo retrospectivo, 12 (6,7%) "limpiaron la infección de VIH". Cada niño tuvo al menos dos resultados PCR positivo en dos momentos de tiempo distintos en el primer año, seguido de numerosos (hasta 7) resultados de PCR negativos. Para la PCR los investigadores utilizaron pares de cebador para las regiones de gen gag, pol y env; y el test se consideró positivo "si al menos dos genes se amplificaban". Al comentar sus resultados los autores escribieron: "Se utilizaron tres habitaciones distintas con circuitos de aire acondicionado independientes para la extracción de ADN, preparación, amplicifación y transferenicia de búfer de PCR. Los amplicones no fueron nunca transferidos en el área reservada para secuencias sin amplificar. De este modo, es improbable que los resultados PCR positivo sean debidos a la contaminación ... Sin embargo, como nuestros ensayos de PCR se realizan en células no manipuladas, es imposible que la contaminación de cultivo lleve a resultados de PCR falsos positivo ... Por lo tanto consideramos que la probabilidad de contaminación repetida de muestras sucesivas del mismo niño es pequeña". Los autores "no pudieron encontrar ninguna correlación entre anticuerpos de mediación de neutralización o de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y el aclaramiento del VIH". De 139 niños nacidos de madres VIH positivo pero que fueron "claramente negativos", "ocho fueron positivos a PCR una vez a un único gen viral (pol), tres fueron positivo dos veces al gen pol, y una vez de las tres también fue positivo al gen gag en un único ensayo" (210).

En 1989, analizando sus estudios sobre los retrovirus humanos, investigadores de la Universidad de Nueva York escribieron: "Cualquiera que sea el origen de los retrovirus humanos, se presencia lleva a ciertas dudas tanto prácticas como teóricas. Actualmente, la principal preocupación práctica es que el uso efectivo de la PCR como un procedimiento de detección para las infeccionesl HTLV-I, HTLV-II y el VIH debe siempre incluir controles adecuados para garantizar que no haya secuencias endógenas que contribuyan a señales positivas. Como ya se ha señalado, los cebadores únicos del VIH correspondientes a la región de transcriptasa inversa altamente conservada mostrada en la Fig. 1 funcionan bien en la amplificación de PCR de ADN de HeLa, incluso a temperaturas de recocido de alrededor de 60 grados ... Otra preocupación práctica es que el uso de la PCR para determinar la posible etiología retroviral de una variedad de enfermedades humanas podría complicarse por los retrovirus endógenos. Incluso si se utiliza el ADNc para plantillas de PCR, deben considerarse las actividades transcripcionales de secuencias endógenas" (119). En un artículo publicado este año, donde discute el diagnóstico de laboratorio de la "infección de VIH", Philip Mortimer escribió: "Existen otros métodos de diagnóstico, por ejemplo el test de antígeno p24, y la amplificación de ADN y ARN proviral, pero estas innovaciones en el diagnóstico del VIH tendrían que compararse frente al test anti-VIH, y deberían rechazarse a menos que cumplan una necesidad que los tests de anticuerpos no cumplan" (211). Según investigadores de la Universidad de Londres, "El uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de la infección por VIH es cada vez más generalizada, y aunque no es todavía igual de fiable que la serología, ha tenido un valor especial en usuarios de drogas intravenosas seronegativos al VIH" (200). Si la PCR tiene que compararse contra el tests de anticuerpos del "VIH" porque es menos fiable que la serología, entonces dado el hecho de que en la actualidad no hay datos que muestren que un test de anticuerpos "VIH" positivo sea prueba de infección con VIH (89), no queda más remedio que estar de acuerdo con Shoebridge et al en que "hasta que se lleven a cabo más estudios moleculares y biológicos, será inseguro lo que respecta a la detección de ADN del VIH-1, incluso aunque se haya mostrado lo que realmente significa el VIH-1 (212). En el análisis de la biología molecular del "VIH", no están a favor las palabras de Sir John Maddox: "¿existe un peligro, en la biología molecular, que la acumulación de datos nos lleve mucho más allá de su asimilación en un marco conceptual, de modo que los datos sean finalmente un estorbo? Parte del problema es que la excitación de la búsqueda deja poco tiempo para la reflexión. Y hay capacidad para producir datos, pero apenas alguna para detenerse y contemplarlos" (213).


Conclusión

Los datos actuales no prueban la existencia de una entidad molecular singular "ADN del VIH" que constituya el genoma de un retrovirus singular adquirido externamente, el VIH. Tampoco hay ninguna prueba de la existencia de un "cuasiespecies de VIH". Tampoco es posible decir qué representan exactamente los distintos "ADN's del VIH", las sondas e cebadores derivados de estos ADN's, y las secuencias en el ADN celular con las cuales se hibridan.


7. "Aislamiento del VIH: La existencia del retrovirus VIH predice que el VIH puede aislarse a partir del ADN cromosómico de las células infectadas. Esta predicción ha sido confirmada como sigue: se han preparado ADN's de longitud completa del VIH-1 y el VIH-2 a partir de células infectadas de virus, y clonadas en plásmidos bacterianos (Fisher et al., 1985; Levy et al., 1986; Barnett et al., 1993). Tales clones están totalmente libres de proteínas celulares y virales, y contaminantes celulares que copurifican con el virus purificado mediante gradientes de densidad convencionales. En efecto, estos clones están incluso libres de ARN del VIH genómico. Los clones de ADN del VIH-1 y VIH-2 infecciosos productivamente infectan a las células humanas para iniciar la replicación del VIH (Fisher et al., 1985; Levy et al., 1986; Barnett et al., 1993). Tales células infectadas ("trasnfectadas") contienen ADN específico del VIH, y producen partículas que contienen transcriptasa inversa; los antígenos específicos del VIH (Fisher et al., 1985; Levy et al., 1986) tienen diámetros de 100 nm en el microscopio electrónico (Fisher et al., 1985), como se espera para los retrovirus".

7.1 Antes de que los datos citados sean discutidos en detalle, para evitar malentendidos, será útil definir algunos términos, incluyendo la clonación de ADN, transfección y clonado de virus, así como los datos que deben presentarse para afirmar tener probados estos fenómenos.

Plásmido: elementos libremente replicantes, cromosómicos circulares presentes en las bacterias. Se duplican independientemente del elemento cromosómico principal, y se utilizan con frecuencia para "llevar" un fragmento de ADN al interior de una célula.

Clonado de ADN: la producción de copias idénticas de un fragmento de ADN , cualquier fragmento de ADN, a partir de un fragmento de ADN ancestral, mediante su unión en un vehículo de clonación adecuado, por ejemplo un bacteriófago o un plásmido;

Transfección: la introducción de ADN exógeno en las células, y su capacidad de replicarse y expresarse a sí mismo en estas células, es decir, la transcripción de ADN en ARN y la traducción del ARN en proteínas. El material genético no tiene que ser de origen viral, y la transfección se puede lograr por varios métodos. Ya en 1969 se sabía que estos métodos pueden incluir "la infección de las células con bacterias y virus, la formación de híbridos de dos tipos de células mediante fusión, el transplante de núcleos simples aislados en huevos y embriones, la microinyección de fracciones de núcleos y mitocondria, y la captación de pinocitosis de ADN purificado". En ese año, Margit Nass de la Universidad de Pennsylvania, aprovechando "las propiedades fagocíticas de los fibroblastos de ratón (células L) crecidas en cultivo en suspensión", demostró que "los fibroblastos de ratón (células L) en cultivo de suspensión incorporaron cloroplastos aislados de espinacas y violetas africanas, y mitocondria aislada de hígado de pollo ... Las células verdes divididas como las células normales. Los cloroplastos verdes fueron seguidos durante cinco generaciones celulares o 5 días, en el que las células híbridas fueron ampliamente sobrepasadas en número por las células descendientes no verdes" (214). Allá por 1989 se vio que la entrega de ADN en las células podría facilitarse mediante reactivos policatiónicos, tales como poli-DEAE Dextron y poliornitina. "Una parte alícuota del reactivo acuoso se añade simplemente al experimento de cultivo de tejidos, junto con el ADN o ARN de interés" (215) (Es de interés que los cultivos-cocultivos derivados de tejidos de pacientes VIH positivo y de sida se tratan con el policatión polibreno y/o agentes oxidantes que pueden llevar a la formación de cationes). En 1990, investigadores de la Universidad de Wisconsin mostraron "que la inyección de ARN o ADN puro directamente en el músculo esquelético de un raton resulta en la expresión significativa de genes indicadores dentro de las células musculares ... vectores de expresión de ARN y ADN que contienen genes para cloranfenicol acetiltransferasa, luciferasa y á- galactosidasa, se inyectaron por separado en músculo esquelético de raton in vivo. La expresión de la proteína se detectó fácilmente en todos los casos, y no se requirió un sistema de entrega especial para estos efectos. La extensión de la expresión de las construcciones de ARN y de ADN fue comparable a la obtenida de fibroblastos transfectados in vitro en condiciones óptimas" (216). Un año más tarde, otro grupo de investigadores de los Estados Unidos mostró que después de la inyección directa en los corazones de los animales "del gen luciferasa de luciérnaga unido a la cadena pesada de miosina ... el corazón se puede transfectar in vivo con mayor eficiencia que el músculo esquelético" (217).

Clonado de virus: la introducción en las células de material genético, ADN o ARN, que se ha probado de antemano que es el genoma de un virus seguido de la aparición en las mismas células de virus idénticos en todos los aspectos a los virus a partir de los cuales se originó el material genómico. Antes de que se pueda afirmar haber probado clonar un retrovirus, se debe:
(a) Obtener una partícula o partículas separadas de todo lo demás (aislada), y mostrar que la partícula contiene, entre otras moléculas, proteínas y ácidos nucléicos (ARN), y que la partícula (o partículas) es ciertamente una partícula infecciosa (ver 6.1).
(b) Mostrar que hay una relación directa entre los ácidos nucléicos y las proteínas de las partículas, es decir, que las proteínas están codificadas por los ácidos nucléicos (el genoma viral);
(c) Introducir el genoma viral (ARN o ADN) en las células y mostrar que el ADN (ADNc) se integra en el ADN celular y se transcribe en ARN, y el ARN se traduce en proteínas (transfecta las células);
(d) Demostrar que las células producen partículas, y que las proteínas de las partículas están codificadas por los ácidos nucléicos de las partículas;
(e) Demostrar que los ácidos nucléicos y las proteínas de las partículas son idénticas a los de la partícula ancestral, y que también son partículas virales;
(f) Debido a que todas las células contienen genomas retrovirales, que en circunstancias apropiadas se pueden expresar en el cultivo, es decir, tanto las células en el cultivo a partir del cual se obtuvieron las partículas originales, así como las células transfectadas, pueden liberar partículas retrovirales idénticas, incluso si no hay clonación, cuando se intenta clonar un retrovirus es de importancia crucial el cultivo de control. La única diferencia entre el control y las células transfectadas con el genoma viral debería ser que, en los cultivos de control, se deberían utilizar algunos otros genes para la transfección. Esto se debe a que, bajo condiciones de cultivo adecuadas, el acto mismo de la transfección podría resultar en la expresión retroviral, incluyendo la producción de partículas retrovirales. Es obvio que la clonación de retrovirus no es sinónimo de aislamiento de retrovirus. De hecho, para la clonación se debe aislar el virus dos veces, la primera vez para obtener el genoma viral, y la segunda vez para demostrar que las partículas, si hubiese alguna, liberadas de la célula tras la introducción del genoma viral son idénticas de aquellas de las que se obtuvo originalmente el genoma.

7.2 En 1985 Fisher, Gallo y sus colegas publicaron un artículo titulado: "Un clon molecular del HTLV-III con actividad biológica" (94). "El clon de fago ^HXB-2 [ver 6.2.2] que contiene provirus de longitud completa (~10 kilobases, kb) con secuencias flanqueantes celulares (12,7 kb de longitud total)" se insertó en el plásmido pSP62. "De modo similar, un fragmento Eco Ri de 13,7 kb de ^CH-1 (un clon molecular que contiene ~9,0 kb de secuencias provirales de HTLV-I) se insertó en" otro plásmido pSV2gpt. "Estas construcciones de plásmidos [pHXB-2D, pCH-1gpt] se transfectaron a continuación en bacterias DH-1 y se utilizaron en experimentos de protoplastos". Se utilizaron como controles el pCH-1gpt e incluso otro plásmido que no contenía "secuencias HTLV (pSVneo)" (no se dan razones por las que utilizan tres plásmidos diferentes). Células mononucleares de sangre de cordón estimuladas con PHA "se fusionaron a continuación con protoplastos bacterianos llevando los plásmidos". "Se establecieron para cada plásmido tres fusiones paralelas utilizando células de diferentes individuos" (no está claro si utilizaron células de 3 o 9 individuos, en este último caso se trata de una razón adicional por la que las condiciones de clonación no podrían haber sido idénticas).

(a) El medio gastado "se concentró 10 veces y se analizó la presencia de transcriptasa inversa" utilizando A(n).dT(15) en los días 5, 11, 14 y 18 tras la fusión. Si las condiciones utilizadas para la transfección eran idénticas y si la transcripción indicó la presencia de un retrovirus, entonces debería esperarse que la RT estuviese presente en los cultivos con pHXB-2D y los tres cultivos con pCH-1gpt. Sin embargo, se informó actividad de síntesis de ADN solamente en dos cultivos con pHXB- 2D (la actividad en uno de ellos fue menos de la mitad que en la otra en cada punto de muestreo), y no se hace ninguna mención respecto a la actividad del tercer cultivo. Además, por alguna razón desconocida, se informó de la actividad de síntesis de ADN solamente durante 18 días después de la transfección, cuando se dijo que era máxima. A diferencia de la actividad de RT, la viabilidad de las células en los cultivos se determinó repetidamente, iniciándose antes de la transfección y hasta 32 días después. Los resultados se presentaron como la media de los tres cultivos para cada plásmido. Si la viabilidad de las células se determinó por la expresión de retrovirus presente en los cultivos, y si el VIH y el HTLV-I posee las propiedades biológicas que se le atribuyen, entonces debería esperarse que el número de células que contienen pSV2neo permanezca constante, se decremente en los cultivos que contienen pHXB-2D, y se incremente en los cultivos con pCH-1gpt. Reportaron que entre el día 18 y 32 el número de células viables disminuyó en todos los cultivos. La disminución fue mas pronunciada en el cultivo con el "clon de VIH", y apareció antes. "Al día 18, sin embargo, el número de células viables en cultivos transfectados con pHXB-2D se había reducido dramáticamente". En otras palabras, la muerte celular más alta ocurrió antes de la máxima producción de VIH (RT) e incluso antes de que el "ADN del VIH" completo se integrase en el ADN celular (ver abajo). Además, ya que al parecer no se detectó actividad de RT en uno de los tres cultivos con pHXB-2D, en este cultivo el número de células debería haber permanecido constante.

(b) Los resultados de los estudios de hibridación se presentan solamente para pHXB- 2D, e incluso ahí para solamente uno de los tres cultivos con este plásmido. "La presencia de secuencias HTLV-III se demostró mediante análisis Southern blot" utilizando "inserto" a partir del clon molecular ^BH-10, "un clon viral incompleto del HTLV-III". "Se detectó una banda de 10 kb, correspondiente a virus lineal no integrado, en muestras de ADN sin digerir preparadas 14 días después de la transfección. La digestión con Xbal reveló tres bandas distintas a 11, 10 y 5,2 kb ... estas bandas probablemente representan las formas circulares melladas, lineales y circulares cerradas de HTLV-III no integrado respectivamente ... La digestión con HindIII, una enzima que corta el genoma del HTLV-III de pHXB-2D seis veces, produjo bandas en 4,5; 2,0 (doblete), 1,7 y 0,6 (un doblete) ... Este patrón de restricción es claramente distinto de la de H9/HTLV-IIIB. No se observaron 'manchas' de alta masa molecular relativa cuando el ADN fue digerido con BamHI. Por lo tanto, no hay datos directos de que el ADN de HTLV-III transfectado sea integrado en el genoma de la célula host ... En experimentos de curso de tiempo (Fig. 36), el ADN aislado de un cultivo único 6, 11, 14, 18 y 31 días después de la transfección con pHXB-2D, se digirió con BamHI y se analizó en búsqueda de secuencias HTLV-III. Seis días tras la transfección, se detectó un fragmento de ADN de 8,6 kb como una banda débil; 18 días tras la transfección fue posible detectar un fragmento de ADN de 1,5 kb además del fragmento de 8,6 kb ... No se detectaron secuencias de HTLV-III 31 días después de la transfección". A pesar de estos hallazgos, los experimentos de curso de tiempo se interpretaron "como prueba de que las células inicialmente transfectadas con pHXB-2D son capaces de producir virus infeccioso completo que se transmite entonces dentro del cultivo".

(c) Los linfocitos de cordón umbilical transfectados de pHXB-2D se reaccionaron con "anticuerpos monoclonales contra las proteínas relacionadas con gag del HTLV-III, p24 y p15 ... la expresión máxima se observó 15 días después de la transfección, cuando del 4-11% y del 5-9% de las células fueron reactivas con anticuerpos a p15 y p24, respectivamente (datos no mostrados) ... En comparación, entre los cultivos H9/HTLV-III, una proporción mucho mayor de células (70-90%) fue positiva a p24 y p15". Además de los muchos problemas asociados con la interpretación de una reacción anticuerpo-antígeno positiva, especialmente con células de cordón umbilical y los antígenos (anticuerpos) gag, como prueba de la infección por VIH, es también interesante notar que:
(i) las reacciones máximas de anticuerpo-antígeno precedieron a la actividad de RT reportada máxima y a las bandas de hibridación;
(ii) no se hizo mención con respecto a la reactividad de los anticuerpos con las células transfectadas pSV2-neo, pero "las células de sangre de cordón eliminadas 18 días después de la transfección con pCH-1gpt (clon HTLV-I) no fueron marcadas por estos anticuerpos". Sin embargo, si como afirma Gallo:
(a) los genes gag del VIH y HTLV-I son homólogos;
(b) hay reactividad cruzada entre las proteínas p24 del HTLV-I y el VIH-1;
el hallazgo reportado de que los "anticuerpos monoclonales contra las proteínas relacionadas con gag del HTLV-III" no reaccionaron con las células transfectadas pCH-1gpt es inexplicable. Sus hallazgos inmunológicos les llevó a escribir: "El hallazgo de que, en cualquier momento, solamente una población menor de las células transfectadas están aparentemente infectadas por el virus (< 15% expresan proteínas virales) sugiere que los efectos citopáticos podrían no ser el resultado solamente de la infección viral directa". Sin embargo, si la caída dramática de células viables en los cultivos transfectados pHXB-2D, donde solamente una minoría de células están "infectadas", está causada ya sea directa o indirectamente por "el clon del HTLV-III con actividad biológica" (efectos citopáticos), ¿por qué tales efectos no se observaron también en la línea de células H9/HTLV-III, donde un porcentaje mucho más alto de células está "infectado" pero tales células se dividen de modo indefinido? Sobre todo, cuando se tiene en cuenta el hecho de que la línea de células H9 (HUT78) se origina a partir de un paciente que "tenía malignidades de células T4 maduras" (6), y se dice que el VIH destruye específicamente celulas T4.

(d) Fisher y sus colegas publicaron una micrografía electrónica que muestra partículas de aspecto viral extracelulares pero sin gemar, algunas de las cuales tuvieron un diámetro de 100 nM. Sin embargo, no probaron que las partículas eran partículas virales, ni siquiera que tuviesen alguna de las demás características morfológicas y físicas de las partículas retrovirales.

7.3 En 1986 Levy y sus colegas publicaron un documento titulado "El clon del retrovirus del sida (ARV-2) se replica en fibroblastos humanos y animales transfectados" (218). El clon molecular l9-B del ARV-2 (ver 6.2.3) se insertó en el plásmido pSp65. El p9B-7 obtenido de este modo, y el l9-B se utilizaron para transfectar la línea de células de monocitos humanos U937 como fueron las líneas de células Jurkat y HUT-78.. El ARV se detectó por la presencia de "actividad de RT en el sobrenadante del cultivo ... se detectó producción de ARV en las células Jurkat y U937 a los 36 y 44 días tras la transfección, mediante la presencia de actividad de transcriptasa inversa (RT) ... Se detectó replicación de virus a los 5 días en la línea HUT-78, con la actividad de RT llegando a más de 200.000 cpm/ml ... El virus de cada cultivo se pasó posteriormente a células mononucleares periféricas humanas normales (PMC) estimuladas con mitógeno ... La actividad de transcriptasa inversa aumentó a más de 106 cpm/ml dentro de los 14 días después de que el virus de las células HUT-78 se pasara a PMC humanas frescas. Las células NIH 3T3 (ratón), MIL (pulmón de visón), COS-7 (mono verde africano) y RD-4 rabdomiosarcoma (humanas) también fueron transfectadas. Se detectó actividad de RT en todas las células dentro de 5 a 14 días tras la transfección. "La detección de virus se vio mejorada mediante la cocultivación de las células de fibroblastos con PMC humanas normales estimuladas con mitógeno ... añadidos cada 3 a 6 días". Los extractos de proteína de "PMC infectado con el virus recuperado de las células transfectadas MIL", las células COS-7 y HUT-78 se sometieron a electroforesis y se hicieron reaccionar con "suero positivo a anticuerpos al ARV ... Los extractos de las células HUT-78 y PMC infectadas contuvieron todos los antígenos del ARV, según se demostró mediante inmunotransferencia (Fig. 2). Estos incluyeron las proteínas de la envoltura gp160, gp120 y gp41, y las proteínas gag de peso molecular 55K, 25K y 16K". No se reportaron tales reacciones en las PMC "no infectadas". Sin embargo, incluso Montagnier informó de que al menos una proteína, la gp41 de células no infectadas reaccionaba con los sueros de los pacientes. La diferencia podría deberse al hecho de que, aparentemente, Monetgnier estimuló las células no infectadas pero Levy no lo hizo. De nuevo, mientras que en células no estimuladas normales los sueros de los pacientes no reaccionan con una proteína p16-18, las mismas proteínas se detectan en células normales no infectadas, pero estimuladas (219-222). Levy y sus colegas también encontraron que "El virus recuperado de todas las células fue citopático a las células HUT-78 ... El virus producido en las células HUT-78 mostró efectos citopáticos (fusión, degeneración de globo) típicos de los retrovirus del sida". Si los efectos citopáticos están causados por un virus que apareció como resultado de la clonación, entonces Levy et al lograron demostrar un efecto del VIH en HUT-78 (H9) que hasta la fecha nadie más ha logrado demostrar. (Es cierto que en 1986 nadie, aparte de Gallo y sus colegas, sabía que la HUT78 es en realidad la HT (H9)).

7.4 En 1993 Barnett, Levy y sus colegas publicaron un artículo titulado "Características distintivas de un clon molecular infeccioso de la muy divergente y no citopática cepa UC1 del virus de inmunodeficiencia humana tipo 2". Este estudio de Barnett, Levy et al se refiere al VIH-2. Dado que se dice que el VIH-2 es totalmente diferente del VIH-1, su aislamiento o clonación, aunque fuera cierto, no constituye prueba del aislamiento o clonación del VIH-1. Sin embargo, puesto que se ha citado pueden ser útiles algunos comentarios. El "virus clonado molecular (VIH-2UC1mc o UC1mc)" se obtuvo como sigue: El ADN celular de "las células SupT1 infectadas de UC1" se "sometió a digestión parcial con EcoRI. Los productos de digestión se fraccionaron por tamaños en gradientes de NaCI, y entonces se ligaron a EMBL4 digerido por EcoRI. Las placas fueron seguidas mediante hibridación a una mezcla de sondas de ADN, incluyendo el virus de la inmunodeficiencia de simo a partir de un macaco, el clon E2 de ADNc env de VIH-2ROD, y una preparación VIH-1SF2 enriquecidas para las secuencias gag-pol ... Aproximadamente 2 millones de placas fueron seguidas, y se obtuvieron 12 placas positivas tras sucesivas rondas de purificación e hibridación de placa. De estos 12 clones positivos, solamente uno se encontró que contenía ADN proviral de VIH-2 de longitud completa tras los análisis de enzima de restricción. El UC1mc clonado Lambda fue transfectado en células RD mediante precipitación de fosfato de calcio, y el virus infeccioso se recuperó tras la cocultivación de estas células con PBMC normales estimuladas con fitohemaglutinina", y este "virus" se utilizó para transferir a otras líneas celulares. La prueba de la clonación de virus y de la existencia de "virus infeccioso" se obtuvo como sigue: "Los sobrenadantes de cultivo se ensayaron cada 3 o 4 días para obtener actividad de transcriptasa inversa. Las muestras celulares también se testearon en búsqueda de expresión de proteína viral mediante un ensayo de inmunofluorescencia indirecto. Los cultivos se examinaron a intervales de 2 o 3 días mediante microscopía del luz en búsqueda de efectos citopáticos, tales como la aparición de sincitios, células grandes, células globo, y restos celulares. Los recuentos de viabilidad de células se determinaron mediante exclusión del colorante azul de tripano. Los análisis de inmunotransferencia se realizaron como se describe anteriormente, mediante la utilización de lisados de virus preparados a partir de sobrenadantes de cultivo celular de células Molt4/8 infectadas con virus. Los sueros provinieron de individuos infectados con VIH o de un conejo inmunizado con gp120 del VIH-2ST recombinante". Informaron: "UC1mc creció bien en el Supt1, Molt4/8 y la línea de células T HUT78, pero no mostraron infección productiva de las células Jurkat o CEM ... UC1mc demostró una relativa incapacidad de inducir la formación de sicintios, eliminar las células, y modular por debajo la superficie de expresión de CD4 en las células infectadas [¿Levy y sus colegas ahora están de acuerdo con nosotros (80) que la aparente pérdida de células CD4 no se debe a su destrucción por el "VIH", sino por la capacidad de los cultivos para "modular por debajo la superficie de expresión de CD4"?] ... Los tamaños moleculares de las proteínas virales UC1mc y sus reactividades con diversos sueros se determinaron por análisis de inmunotransferencia. Mientras que la mayoría de las proteínas virales UC1 y UC1mc fueron reactivas con sueros de individuos infectados con el VIH-2, la glicoproteína Env de la superficie de la célula (gp140: SU) fue generalmente poco reactiva con estos sueros en comparación con las gp140 de otras cepas del VIH-2 (por ejemplo, VIH-22UC3 mostrado). En contraste, las moléculas gp140 de UC1mc y UC1 parecían reaccionar bien con anticuerpo de conejo específico de Env surgido contra la proteína VIH-2ST SU". Para la caracterización molecular del UC1mc, "El genoma UC1mc entero se sometió a análisis de secuencia de ADN para determinar su estructura genética y la relación de su estructura de proteínas deducida con las de otras cepas de VIH conocidas. Se encontró que la secuencia de ADN proviral de UC1mc era 10.271 bp de larga, y su estructura genética global parecía ser similar a los de otras cepas VIH-2 secuenciadas ... Mediante análisis de secuencia, el UC1mc pareció divergir sustancialmente de la mayoría de otras cepas del VIH-2. Las diferencias fueron más notables en los muy bajos porcentajes de identidad de las secuencias de aminoácidos de Env; proteínas regulatorias virales Tat, Rev y Nef; y proteínas accesorias virales Vif, Vpx y Vpr. La divergencia de UC1mc fue más sutil, pero sin embargo significativa en las proteínas Gag y Pol, generalmente más conservadas" (223) (cursiva nuestra).


7.5 Comentarios

Ni Fisher et al, ni Levy et al ni Barnett et al cumplieron las condiciones absolutamente necesarias para afirmar la clonación de un retrovirus, el VIH. Ni era posible que lo hiciesen. Para clonar molecularmente un retrovirus primero debe obtenerse el ARN retroviral, y esto solamente puede hacerse mediante el aislamiento del retrovirus. SI NO HAY AISLAMIENTO NO HAY CLONACION. Sin embargo, hasta la fecha, no sólo ningún investigador ha aislado un retrovirus singular de tejidos frescos de pacientes de sida, o incluso de cultivos-cocultivos que contienen material de estos pacientes, sino que tampoco ningún investigador ha probado la existencia de partículas, virales o no virales, que cumplan las propiedades morfológicas y físicas principales de los retrovirus (146). Fisher et al, Levy et al y sus colegas, mediante varios medios, seleccionaron fragmentos de ADN y los llamaron "ADN del VIH", sin probar que perteneciesen a una partícula, cualquier partícula, y sin que ni siquiera dos fragmentos fuesen de la misma composición o longitud (ver 6.2). Posteriormente, trataron de introducir el "ADN del VIH" en las células, utilizando técnicas bien conocidas mediante las cuales es posible introducir cualquier ADN, viral o no viral, en las células. Independientemente de lo que se entienda por "ADN del VIH", dadas las técnicas que utilizaron, es muy probable que tuviesen éxito. Sin embargo, solamente se puede afirmar tener pruebas mediante la secuenciación de "ADN del VIH" tanto antes como después de la clonación en las células, y ninguno de estos grupos lo hizo. Los únicos datos presentados por los anteriores investigadores a este efecto y, de hecho, a la clonación de virus fueron:
(a) La detección en cultivos de células de actividad de RT (transcripción de A(n).dT15);
(b) El hallazgo en las células de proteínas ("las proteínas de la envoltura gp160, gp120 y gp41, y las proteínas gag de pesos moleculares 55K, 25K y 16K") que reaccionaban con anticuerpos a la p24 y/o con los sueros de pacientes de sida. Sin embargo, hasta ahora, nadie ha demostrado que ninguna de las proteínas anteriores que están presentes en los fragmentos celulares y que reaccionan con el suero de los pacientes de sida estén realmente codificadas por los marcos de lectura abiertos env y gag del "VIH" (ver 5).
Tampoco es prueba de la existencia del VIH o de cualquier otro retrovirus endógeno o exógeno la presencia de partículas de aspecto viral en los sobrenadantes de cultivo ni la transcripción de A(n).dT15 (ver 3.0). Incluso si hubiese prueba de que las partículas fuesen realmente retrovirales y de que la transcripción inversa de A(n).dT15 fuese inducida por una enzima retroviral, las proteínas fuesen proteínas retrovirales y los anticuerpos estuviesen dirigidos específicamente contra tales proteínas, su hallazgo en cultivos de células no es una prueba de la transfección del "ADN del VIH", y menos aún de la clonación del "VIH". Todos estos fenómenos podrían estar causados por un retrovirus endógeno, especialmente si se considera el tipo de células utilizado, linfocitos leucémicos y de cordón umbilical, y las condiciones, estimulación química y técnicas de cocultivo. Según Kurth y sus colegas, "se ha acumulado en los últimos años datos indirectos acerca de que algunos loci provirales endógenos también deben expresarse en los seres humanos ... La expresión de la información retroviral también fue sugerida por la demostración de la actividad de la transcriptasa inversa y por la detección de antígenos de reactividad cruzada con antígenos retrovirales animales en diversas células y tejidos humanos" (116). Los sueros de pacientes de sida contienen anticuerpos dirigidos contra muchos autoantígenos y no autoantígenos, incluyendo linfocitos (89, 224, 225), y los sueros del 70% de los pacientes de sida reaccionan con antígenos de "Los virus en todos nosotros", es decir, retrovirus endógenos (175). En una publicación de 1989 por investigadores de Suecia, Japón y los Estados Unidos se lee: "en los años 60 y 70 estuvieron disponibles nuevas técnicas (morfológicas, inmunológicas, y de biología molecular), no solamente para encontrar retrovirus exógenos y endógenos, sino también para correlar la expresión de retrovirus con ciertas enfermedades humanas ... Estudios de microscopía electrónica revelaron partículas con una morfología retroviral en algunos tejidos humanos normales y neoplásicos, y también en la leche, la orina y algunos otras efusiones. Se desarrollaron radioinmunoensayos sensibles, lo que condujo a la detección de antígenos [incluyendo proteínas gag en sueros de sangre de cordón umbilical] relacionados con las proteínas de retrovirus exógenos murinos y de primate conocidos, y se encontró transcriptasa inversa (RT) en distintos tejidos normales y neoplásicos" (108). "Tres ARNm's poliadenilados HERV-R [retrovirus-R endógenos humanos] (9; 7,3; y 3,5 kilobases) se expresan en el tercer trimestre y las vellosidades de placenta. Un estudio exhaustivo de la expresión HERV-R en tejidos humanos reveló que la mayoría de los otros tejidos también expresan los ARNm's de 9 y 3,5 kilobases a un nivel de aproximadamente un 10% de los de en la placenta ... La mayor expresión además de las vellosidades placentarias fue en la línea de células de leucemia monocítica U937", una de las líneas de células empleadas por Levy et al. Otra de las líneas de células utilizadas por Levy et al en el estudio de 1986, COS-7, fue de un mono verde africano. Desde entonces se ha mostrado que los monos verdes africanos están infectados con el SIV, e incluso antes, en 1983, se dice que están infectados con "virus de leucemia de células T adultas" (226). La línea de células RD utilizada por Levy es una línea de células de rabdomiosarcoma humano, y por muchos años estas células han sido conocidas por expresar información viral y liberar partículas de aspecto retroviral (227). Para la clonación, Fisher et al y Levy et al obtuvieron su "ADN del VIH" de la línea de células HUT78 (H9). Esta es también la línea de células de la que Fisher y sus colegas obtuvieron la mayor parte de sus datos acerca de la "clonación del VIH-1". Incluso si uno asume que el "ADN del VIH" es ciertamente retroviral, de lo que no hay prueba, no se puede suponer que sea el "genoma del VIH". Según Gallo, la línea de células HUT78 (H9) está infectada con el HTLV-I (6). Si es así, entonces todos los cultivos de células HUT78, y los clones que se derivan de ello, "infectados con HTLV-III" o no infectados, y el material de estos cultivos que se concentra en la banda de 1,16 g/ml, debería contener HTLV-I, y por lo tanto RT y partículas retrovirales. Además, debido a que el 25% de los pacientes de sida tienen anticuerpos al HTLV-I, y las proteínas inmunogénicas del HTLV-I y el VIH tienen los mismos pesos moleculares, entonces aproximadamente el 25% de los cultivos HUT78 (H9) no infectados, además de RT y partículas, deberían tener, en el Western blot, las mismas bandas que la de los cultivos"infectados por el HTLV-III". De este modo, los fragmentos celulares de las células HUT78 y los Western blots aparecerán erróneamente como positivos al HTLV-III. Tanto el grupo de Gallo como el de Montagnier mostraron que los genes gag y pol del HTLV-I y el VIH-1 son homólogos. Esto significa que la línea de células HUT78 debería tener secuencias de "ADN del VIH", incluso cuando no están transfectadas con el "ADN del VIH".

A diferencia de Fisher et al, Levy no realizó estudios de hibridación. Sin embargo, Fisher, Gallo y sus colegas no pudieron hallar datos de que el "ADN del HTLV-III está integrado en el genoma de la célula del huesped", un paso absolutamente necesario en la clonación y la producción de los retrovirus. Ni tampoco ha demostrado ninguno de estos investigadores que el ADN se transcriba en ARN. Para la transfección, además de demostrar la integración del "ADN del VIH" en el genoma de la célula huesped y su transcripción en ARN, también se debe demostrar que el ARN se traduce en proteínas.


Conclusión

Para afirmar que "La existencia del retrovirus VIH predice que el ADN del VIH puede aislarse a partir del ADN cromosómico de células infectadas", primero hay que tener prueba de la existencia de una molécula singular de ADN , que es el genoma de una partícula de retrovirus singular, el VIH-1, que solamente puede obtenerse mediante el aislamiento de la partícula retroviral. En la actualidad no existe tal prueba. Fisher et al y Levy et al seleccionaron una porción de ARN, el cual, a partir del sobrenadante de células HUT78 "infectadas", se concentraba en la banda de 1,16 g/ml o tenían una cierta longitud, le hizo transcripción inversa y lo llamó "ADN del VIH-1" (ver 6.2.2, 6.2.3). Sin embargo, puesto que ni ellos ni nadie han demostrado que este ARN (ADNc) sea ni siquiera la parte constituyente de una partícula, cualquier partícula retroviral o alguna otra, la afirmación de que el ADN es la "longitud completa del VIH-1" o "específico del VIH" no se sostiene. En los fragmentos celulares de células "transfectadas" Fisher et al and Levy et al encontraron algunas proteínas con pesos moleculares similares a los de las "proteínas del VIH", que reaccionaban con sueros de pacientes de sida. También encontraron la transcripción inversa de A(n).dT15 en el sobrenadante del cultivo, pero no presentaron ningún dato de que las proteínas o la RT fuesen los constituyentes de una partícula, viral o de otro tipo, y por tanto no pueden afirmar haber probado que las células "transfectadas produzcan partículas que contengan transcriptasa inversa, antígenos específicos del VIH". Aunque Fisher y sus colegas tenían una micrografía electrónica mostrando partículas con aspecto viral en el sobrenadante del cultivo, no probaron que las partículas eran realmente partículas retrovirales, ni siquiera que tuviesen algunas de las características más básicas morfológicas y físicas de las partículas retrovirales, y por tanto "podría no ser para nada material viral". Fisher et al, Levy et al y Barnett et al no comenzaron por probar que el ARN (ADNc) fuese el ARN de un retrovirus, y no obtuvieron partículas retrovirales que se probase que contuviesen el mismo ARN, un requisito básico para la clonación. De hecho, según sus datos no pueden ni siquiera afirmar la transfección de células con un ADN, viral o no viral.


8. "Identificación del VIH"

8.1 "La existencia del VIH predice que las células infectadas contienen un ADN específico de virus singular de 9150 nucleótidos que no se puede detectar en el ADN de células no infectadas".

El genoma de un retrovirus no se puede identificar sobre la base de la longitud de un fragmento de ARN (ADNc) y su presencia en algunas células y no en otras.

8.1.1 Utilizando fragmentos de "ADN de VIH" como sondas de hibridación o cebadores, se han obtenido resultados positivos, tanto con hibridación estándar como con PCR, a partir de ADN de células humanas "no infectadas" e insectos (ver 6.4.4). Es un hecho que:
(a) la hibridación de ácidos nucléicos de retrovirus exógenos "de diferentes especies da un patrón que es el mismo que la relación filogenética entre sus huéspedes naturales" (228), una relación que llevo a los retrovirólogos, incluyendo a Gallo a concluir que los retrovirus exógenos "se derivan de genes de la célula";
(b) la existencia de retrovirus humanos endógenos se ha probado utilizando sondas de hibridación derivadas de retrovirus animales endógenos y exógenos. Si este es el caso y si el "ADN del VIH" es el genoma de un retrovirus humano exógeno, el genoma humano no infectado debería contener secuencias que se hibridarán con sondas de "ADN del VIH". Puede haber dos razones por las cuales tales hallazgos no han sido reportados con más frecuencia:
(i) La mayoría de los investigadores del VIH ignoran uno de los requisitos más importantes de la investigación experimental básica, es decir, los controles. En los pocos casos en que se utilizan controles, no son adecuados (ver 6.1). En los años 70, Gallo, Gillepsie y sus colegas decían que el éxito del "ensayo de hibridación parece depender de la historia biológica del virus", y en el estado fisiológico de las células (125, 228). En un gran estudio publicado en 1975, titulado "Relación entre los Componentes en Virus de Tumor de ARN Primates, y en el Citoplasma de Células de Leucemia Humanas: Implicaciones de la Génesis de la Leucemia", el propósito fue demostrar que las células de leucemia humanas, y no las células normales, tienen propiedades asociadas con retrovirus que incluyen secuencias genómicas retrovirales. Se reportó que "La partícula citoplasmática de células sanguíneas leucémicas humanas que contienen actividad de transcriptasa inversa es capaz de sintetizar ADN in vitro utilizando ARN endógeno tanto como plantilla como cebador. Esta actividad endógena se ha utilizado para aprender sobre la naturaleza de la partícula en sí misma. Muchas partículas citoplasmáticas intracelulares u orgánulos (descritas de modo general en la tabla 8) pueden llevar a cabo síntesis de ADN endógeno in vitro. Estos incluyen las mitocondrias, partículas citoplasmáticas pequeñas de baja densidad, 1,10-1,16 g/cc en gradientes de densidad de sacarosa, y partículas citoplasmáticas pequeñas de mayor densidad, 1,17-1,19 g/cc en gradientes de densidad de sacarosa ... Se han detectado pequeñas partículas en la fracción citoplasmática e los linfocitos estimulados con fitohemaglutinina de donantes normales ... Estas partículas realizaron síntesis de ADN endógeno, y la población de ADN resultante contuvo secuencias relacionadas con los genomas de los virus de tumor de ARN. Se encontraron secuencias relacionadas con virus en pacientes con algunos tipos de leucemia, incluyendo AML, CML, CML-A y CLL. Los intentos para detectar secuencias virales en ARN de células leucémicas mediante la hibridación de ADN sintetizado mediante virus de animales a ARN aislado a partir de partículas pequeñas citoplasmáticas (el experimento de hibridación recíproco), en nuestra opinión no consigue encontrar diferencias en secuencias en ARN de glóbulos blancos periféricos humanos leucémicos y dividiéndose normalmente [estimulados con PHA]. Se ha reportado por otros que las sondas de ARN radioactivas sintetizadas por MuLVR hibridan a ARN citoplasmático a partir de glóbulos blancos leucémicos, pero no con los normales. Una diferencia entre nuestros experimentos y los reportados previamente es que las células humanas normales utilizadas como una fuente de ARN se están dividiendo activamente, mientras que la mayoría de las utilizadas en estudios previos no" (125) (cursiva nuestra).
(ii) El "ARN del VIH" no es el genoma de un retrovirus exógeno ni endógeno, ni siquiera el fragmento de ADN transcrito presente en en células sin "shock".

8.1.2 La mayoría de los resultados positivos en "células no infectadas" se han encontrado utilizando sondas e cebadores para uno o como máximo dos genes, o incluso fragmentos de genes. La "gran mayoría" de los estudios del VIH abarca del "2% al 30% del genoma" (163). Sin embargo, el encontrar un fragmento de un gen o incluso un gen no prueba la existencia del genoma del VIH.

8.1.3 Montagnier y sus colegas reportaron que el "ADN del VIH" era de 9 ± 1,5 Kb (91) , mientras que Gallo y sus colegas reportaron que "La longitud total del provirus HTLV-III es de aproximadamente 10 kilobases" (96). En el primer estudio del "genoma del VIH" de Levy y sus colegas, la "banda ancha (>15Kb) representa provirus integrado dentro del ADN de la célula host" (98). En 1995, investigadores del Instituto Pasteur reportaron que "se ha determinado la secuencia de 9193 nucleótidos completa como agente causal probable del sida, el virus asociado a linfadenopatía (LAV). La estructura genética deducida es singular; muestra, además de los genes gag, pol y env retrovirales, dos marcos de lectura abiertos nuevos que llamamos Q y F" (229). En el mismo año, Gallo y sus colegas reportaron sus resultados acerca de las secuencias de nucleótidos de "VIH" utilizando el clon BH10, pero también añadieron: "La secuencia del restante 182 bp del provirus HTLV-I no presente en el clone BH10 (incluyendo una porción de sitio de unión de cebador R, V5, ARNt, y una porción de la secuencia de cabecera) se derivó del clon HXB2 ... Es de destacar la presencia de una quinto marco de lectura abierto (nucleótidos 8.344 a 8.891) designada como 3'orf, presente en el clon BH8 pero truncado en BH10". Concluyeron "La secuencia de nucleótidos completa de dos ADN's provirales de leucemia de células T humanas tipo III (HTLV-III), tiene cada una cuatro marcos de lectura abierto largos, correspondiendose los dos primeros a los genes gag y pol. El cuarto marco de lectura abierto codifica dos polipéptidos funcionales, un gran precursor de la glicoproteína de envoltura principal y una proteína más pequeña derivada del marco de lectura abierto largo 3' terminal, análogo al marco de lectura abierto largo (lor) producto del HTLV-I y II. El provirus HTLV-III es 9.749 pares de bases (bp) de largo" (32). En 1990 se dijo que el genoma del VIH consistía de diez genes (230). Ese año Montagnier reportó que el VIH poseía 8 genes (7), y Barré-Sinoussi (8) que el VIH tenía 9 genes.

Hasta la fecha no se ha reportado dos "ADN del VIH" de la misma longitud, y además se acepta que la mayoría de los "genomas del VIH" son defectuosos. Incluso si todos los genes se pueden amplificar mediante la PCR, todavía no significa que el "genoma del VIH de longitud completa" esté presente. Por ejemplo, en 1995 el gen nef de 3 de los miembros receptores de sangre de la cohorte "Bloodbank" de Sydney y del donante se amplificaron mediante la PCR. Los fragmentos amplificados resultantes para los tres receptores oscilaron entre 410 bp y 680 bp. Un recipiente produjo fragmentos de dos tamaños ... El fragmento amplificado del donante (D36) fue ~550 bp de longitud, indicando un borrado de ~290 bp ... comparado con el fragmento de ~840 bp del clon molecular pNL4-3" (231). En 1995 David Ho y sus colegas "analizaron mediante reacción en cadena de la polimerasa y secuenciación directa 57 secuencias virales de 47 individuos de origen norteamericano, australiano y haitiano infectados con el virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), centrándose en las regiones V1 y V2 de la gp120. Hubo un largo polimorfismo en la región V1, lo que hace difícil la alineación de secuencia. La ubicación hipervariable V2 también mostró variaciones de longitud considerables, mientras que las regiones que flanquean se conservaron relativamente" (232). Por lo que se refiere a Gallo, no es ni siquiera un requisito que el genoma del "VIH" posea ningún gen en absoluto para ser patogénico: "Esto sugiere que los viriones defectuosos, tales como las partículas libres de ARN y/o proteínas virales expresadas en la ausencia de formación de partículas contribuyen a la patogénesis del sida" (114).

8.1.4 Buscando en la literatura del VIH es sorprendente que, hasta la fecha, no se ha secuenciado ni un solo "genoma del VIH de longitud completa" de 9150 bp o de cualquier longitud a partir de células no cultivadas frescas. "La baja abundancia de ADN proviral de VIH-1 en muestras clínicas es una barrera para el análisis del genoma completo del provirus VIH-1, como ocurre in vivo". Todos los "genomas del VIH de longitud completa" secuenciados hasta el momento lo han sido a partir de células cultivadas, de hecho "los genomas del VIH-1 de longitud completa secuenciados completamente en la base de datos actual de Los Alamos se ha derivado, casi sin excepción, de los aislamientos de VIH-1 hechos crecer en líneas de células T [leucémicas o transformadas] continuas". Tan tarde como en 1995 "solamente se habían reportado 19 secuencias abarcando de longitud completa, 10-Kb del genoma del VIH-1, y la mayoría deriva de aislamientos del VIH-1 de genotipo B expresados en líneas de células continuas. Cinco de los ocho subtipos genéticos más frecuentes del VIH son sin un prototipo secuenciado de longitud completa único" (193). En la actualidad también se sabe que:
(a) los pacientes que pertenecen a los grupos de riesgo del sida están expuestos a altas dosis de agentes oxidantes, y que estos agentes tienen efectos profundos en el ADN y el ARN (74, 79);
(b) el "VIH" no se puede detectar en cultivos a menos de que estos sean tratados con oxidantes químicos o físicos, como el PHA;
(c) existen anormalidades estructurales y funcionales en el genoma de linfocitos de los pacientes de sida. "Los pacientes de sida han mostrado unos mayores niveles de síntesis espontánea de reparación del ADN (3 veces mayor), una cantidad mayor de roturas del ADN de cadena simple (11-18%), una capacidad menor de restaurar el daño del ADN (de 2 a 2,5 veces menor) comparado con las personas sanas" (233);
(d) según Chermann y sus colegas, "poblaciones distintas de fragmentos de ADN del VIH-1 singulares de tamaño altamente variable que va desde 600 bp al provirus de longitud completa, estuvieron presentes en PBMC de personas infectadas con el VIH ... Genomas defectuosos tendieron a desaparecer gradualmente tras la activación de PBMC con fitohemaglutinina" (234);
(e) Según los expertos del VIH, los genomas defectuosos son "rescatados" mediante la recombinación, siendo esta recombinación una de las causas principales de la complejidad del "ADN del VIH". Si fuese este el caso, uno podría preguntarse:
(i) ¿se puede excluir la posibilidad de que todos los 19 "genomas del VIH de longitud completa" descritos hasta el momento , incluso si tuviesen todos ellos la misma longitud de 9150 bp y secuencias idénticas, no sean más que un hallazgo casual entre las muchas especies moleculares presentes en los cultivos, o incluso los linfocitos sin cultivar, que nada tienen que ver con un genoma retroviral y que aparecieron como resultado de las condiciones in vivo o in vitro o ambas, y de la selección natural?;
(ii) si hay tal alta tasa de recombinación entre los genomas del VIH , ¿no sería posible que el mismo proceso tenga lugar entre genomas retrovirales endógenos? Si este fuera también el caso, ¿cómo puede uno saber que los 19 "genomas del VIH de longitud completa" no son más que recombinaciones entre secuencias retrovirales endógenas, secuencias retrovirales endógnenas y secuencias celulares, por ejemplo, retroelementos no retrovirales? Como se ha señalado, los investigadores del VIH no suelen utilizar controles, y hasta la fecha no han utilizado controles adecuados, es decir, tejidos o cultivos derivados de individuos que no tienen sida y que tienen una enfermedad similar, en donde las técnicas y condiciones experimentales empleadas sean idénticas excepto la presencia del supuesto material retroviral. Sin embargo, si los investigadores del VIH u otros capaces de montar este tipo de experimentos fuesen animados a poner tanto esfuerzo como el que ponen en estudiar el "VIH" de linfocitos de pacientes en riesgo, en estudiar los linfocitos de pacientes no en riesgo pero:
(a) que están expuestos a agentes (distintos al "VIH") y dosis similares a aquellos en los grupos de alto riesgo;
(b) que tienen anormalidades estructurales y funcionales similares a los linfocitos de pacientes de sida o aquellos en riesgo;
(c) utilizando exactamente los mismos métodos y condiciones de cultivo a los utilizados por los investigadores del "VIH"
¿se puede excluir la posibilidad de que en otros diez años estos investigadores no sean capaces de reportar "19 genomas del VIH de longitud completa" en estos individuos?

8.2 "Por ejemplo, Jackson et al. testearon células sanguíneas de 409 positivos de anticuerpos, incluyendo 144 pacientes de sida y 265 personas sanas. Además, se testearon 131 negativos de anticuerpos. En 403 de los 409 de los positivos de anticuerpos se encontraron subconjuntos de ADN específicos al VIH definidos en tamaño y secuencias mediante cebadores específicos del VIH, pero en ninguno de las 131 personas negativas de anticuerpos (Jackson et al., 1990)".

8.2.1 Al parecer, hasta 1987 Jackson et al consideraban la detección de RT (retrotranscripción determinada por la transcripción de A(n).dT15) en cultivos como sinónimo de aislamiento del VIH. Sin embargo, consiguieron una "tasa de aislamiento del 57% en pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida". En 1988, el "ensayo de la transcriptasa inversa se reemplazó con la prueba de detección de antígeno del VIH-1 de los Laboratorios Abbot", que "detecta principalmente el antígeno de núcleo p24 del VIH-1 ... Se considero positivo por antígeno del VIH-1 a un cultivo si dos muestreos de sobrenadante consecutivos eran positivos, con el último muestreo mostrando una mayor actividad". El VIH-1 fue aislado a partir de PBMC de 141 (99,3%) de 142 positivos de anticuerpos al VIH-1" (235). En su artículo de 1990 Jackson et al reportaron que "Entre febrero de 1987 y octubre de 1988, se cultivaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de 409 individuos que fueron positivos a anticuerpos al VIH-1 mediante el Western (inmuno) blot (56 pacientes de sida, 88 pacientes con ARC y 265 individuos asíntomáticos)". Utilizando la técnica sensible antes descrita, la prueba de p24 mencionada antes, reportaron que "el VIH-1 se puede aislar en 100% (56 de 56) de los pacientes de sida, 99% (87 de 88) de los pacientes con ARC, y en el 98% (259 de 265) individuos asintomáticos positivos a anticuerpos al VIH-1". Ninguno de los "131 individuos negativos a anticuerpos tuvieron un cultivo positivo". Utilizando la misma prueba de p24 (Abbot) testearon el suero de 403 de 409 personas. El test fue positivo en 23/56 (42%) pacientes de sida, 31/88 (57%) de pacientes con ARC y 44/259 (17%) de individuos positivos a anticuerpos asintomáticos. Por motivos no especificados, un test de suero positivo se consideró como prueba de detección de "antígeno de VIH-1 en suero", mientras que el mismo test de cultivo positivo se consideró como prueba de "aislamiento del VIH-1" del cultivo. Hay muchas razones para cuestionar la interpretación de la prueba de p24:
(a) La prueba de p24 es una reacción anticuerpo-antígeno y es propenso a reactividad ambiental ubicua. En este contexto, incluso si se tuviesen "dos muestreos de sobrenadante consecutivos, con el último muestreo mostrando una mayor reactividad", incluso si el doble o el triple, por ejemplo, 30 y 60,k o 30 y 90, ambas lecturas podrían ser solamente lecturas ambientales. Los criterios de Jackson y sus colegas ni siquiera concuerdan con los utilizados con Ho et al, que son igual de arbitrarios; "Se consideró a un cultivo positivo si la concentración del antígeno p24 en el sobrenadante excedía los 1000 pg por mililitro (valor típico de corte de aproximadamente 30 pg por mililitro) en una sola determinación, o de 200 pg por mililitro en dos o más determinaciones" (51). A este respecto es importante tener en cuenta que ninguna de variaciones experimentales y de mejoras tecnológicas en el test de p2 puede cambiar la naturaleza subyacente del test. El test solamente detecta reactividad anticuerpo-antígeno, y la razón subyacente a tal reactividad no se puede determinar sobre la base de un corte arbitrario. A priori, no hay motivo por el que las condiciones que llevan a una reactividad no específica no deban estar presentes a un nivel suficiente para llevar la reacción por encima del corte, ni ninguna razón para lo contrario, es decir, que las reactividad sea específica por debajo del corte. El único modo de resolver este problema es comparar la reactividad con la presencia o ausencia del VIH, determinada por el aislamiento del virus. Hasta la fecha, esto no ha sido reportado. Incluso sin un estándar oro, la no especificidad del test de antígeno p24 es tan obvia que es aceptada por una autoridad en el test del VIH, Philip Mortimer y sus colegas del UK Public Health Laboratory Service. "La experiencia ha demostrado que ni el cultivo de VIH ni los tests de antígeno p24 tienen mucho valor como prueba de diagnóstico. Podrían ser no sensitivos y/o no específicos" (236). El hecho de que en experimentos con "estudios de dilución en serie de sobrenadantes de cultivo" sea más probable que el test de p24 sea positivo que la RT, no prueba que el test p24 sea "al menos 100 veces más sensitivo que los ensayos de transcriptasa inversa". La sensibilidad del VIH solamente se puede medir mediante el uso del aislamiento del VIH como estándar oro (237);
(b) No hay razones científicas y, ciertamente, no hay razones de sentido común para considerar reacciones como la retrotranscripción o las reacciones anticuerpo-antígeno como prueba de aislamiento viral. Si estos fenómenos se consideran como prueba de aislamiento de virus, entonces el test de embarazo (medida de la proteína bHCG en sangre o en la orina utilizando anticuerpos) o la estimación de enzimas cardiacas en una sospecha de infarto de miocardio, deberían también considerarse como prueba de "aislamiento" de la placenta o el corazón respectivamente.

Para mejorar la prueba de p24, se ensayó mediante PCR el ADN extraído de PBMC no cultivados congelados de sus siete "sujetos negativos en cultivo y positivos a anticuerpos" y "23 individuos heterosexuales sanos negativos en cultivo y negativos a anticuerpos del VIH-1". Además, "con el fin de comparar la sensitividad y especificidad" de los dos tests, PCR y cultivo, se analizó las PBMC de 59 individuos seropositivos y 20 seronegativos en ambos tests. Las amplificaciones de VIH-1 se realizaron utilizando un par cebador, el SK38-39, que amplifica una región conservada de 115 pares de bases del gen gag (nucleótidos 1551 a 1665 del SF23 del VIH: GenBank adhesión no. K02007). El producto amplificado se detecto mediante hibridación de oligómero, una técnica en la que una sonda etiquetada como 32p final (SK19) al nucleótido 1595 al 1635 de la región gag hibrida en solución a una hebra de la secuencia amplificada. El dúplex de objetivo de sonda se resolvió entonces por electroforesis en un gel de poliacrilamida al 10% y se autorradiografiaron". No se reportó que ninguno de los individuos seronegativos tuviese un test de PCR positivo". Todas las muestras de ADN iniciales procedentes de los 7 pacientes negativos en cultivo, positivos a anticuerpos" se reportaron como positivas. Cuando se compararon los tests de PCR y de cultivo, 57 de los 59 pacientes tuvieron un PCR positivo, y 57 de los 59 pacientes tuvieron un cultivo positivo. Los dos invidividuos negativos a la PCR tuvieron cultivos positivos, y los dos individuos negativos en cultivo tuvieron una PCR positiva. Los autores concluyeron: "Aislamos el VIH-1 o detectamos secuencias de ADN del VIH-1 de las PBMC de todos los 409 individuos positivos a anticuerpos del VIH-1. Ninguno de los 131 individuos negativos a anticuerpos al VIH-1 fueron positivos en cultivo de VIH-1, ni fueron las secuencias de ADN del VIH-1 detectadas mediante la PCR en los especímenes de sangre de 43 individuos seronegativos. Se vio que ambos métodos tenían sensibilidades y especificidades de al menos 97% y 100% respectivamente ... Nuestra capacidad para demostrar directamente la infección de VIH-1 en todos los individuos positivos a anticuerpos del VIH-1 proporciona un apoyo definitivo de que la positividad de anticuerpos al VIH-1 se asocia con la presencia de la infección de VIH-1" (52). En otras palabras, Jackson et al utilizaron los tests de anticuerpos como un estándar oro tanto para los tests en cultivo y de PCR, y los tests de PCR y de cultivo como estándar oro para el test de anticuerpos.

Las afirmaciones de Jackson et al no están ni siquiera confirmadas por otros laboratorios. Según Jackson et al, hasta 1990 solamente tres estudios pequeños informaron "tasas de aislamiento del 100% del VIH-1 de pacientes de sida". En todos los otros estudios, el "VIH-1 no fue aislado en 6% a 50% de los casos seropositivos de sida reportados. La tasa de recuperación del cultivo del VIH-1 a partir de pacientes asintomáticos positivos a anticuerpos había sido generalmente incluso menor, solamente del 20% al 42% en algunos estudios". La situación mas reciente se ilustra mejor con un gran estudio de la OMS publicado en 1994. Entre 1992-93 se recogieron especímenes en Brasil, Ruanda, Tailandia y Uganda de individuos "positivos al VIH" asintomáticos. El estado serológico se confirmó primero en el país de origen y luego en los "laboratorios centralizados responsables de confirmar la serología, el aislamiento del virus, la expresión del virus, y la distribución de los reactivos (George-Speyer-Hans Chemotherapentisches Forschunginstitut (GSH) en Frankfurt, Alemania; National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) En Londres, Gran Bretaña; y DAIDS/NIAID en Bethesda, Maryland, Estados Unidos)". Utilizando el método de Jackson et al, "de un total 224 de cultivos de virus, 83 fueron positivos (tasa de aislamiento = 37%)" (238). Los resultados de PCR de Jackson et al, al igual que sus resultados de cultivo, no son reproducibles en otros laboratorios. Por ejemplo, en un estudio realizado por Defer y sus colegas, donde las mismas muestras fueron testeadas en "Siete laboratorios franceses con amplia experiencia en detección mediante PCR del ADN del VIH", los datos revelaron que de 138 muestras que mostraron contener el "ADN del VIH", 34 (25%) no contenían "anticuerpos del VIH", mientras que de 262 especímenes que no contenían "ADN del VIH", 17 (6%) contenían "anticuerpos del VIH" (197). En un artículo publicado en 1994 por investigadores del The Laboratory of Molecular Retrovirology Georgetown University, Chiron Corporation California, Retrovirology Section, US National Institutes of Health, Maryland, los autores observaron que las técnicas de PCR son "excesivamente trabajosas y tienen variaciones de laboratorio en laboratorio debido a las diferencias en la técnica y las operaciones" y que "en algunos estudios reportados no hay correlación entre los niveles de antígeno p24 y las mediciones de viriones infecciosos. De modo similar, una disminución del nivel de antígeno p24 no está necesariamente asociada con un resultado clínico positivo". Debido a esto, para "monitorizar la carga de Virus de Inmunodeficiencia Humana de Tipo 1 en plasma humano" los autores utilizaron "el ensayo de amplificación de señal de ADN ramificada", el cual "ofrece una mayor sensibilidad", y compararon el mismo con los "otros dos ensayos estándar de carga viral; cultivo de plasma de dilución de punto final y antígeno p24 de suero disociado complejo inmune (ICD)". Reportaron que el "ADN del VIH-1" y los ensayos de antígeno p24 de suero ICD se realizaron en muestras de suero de 102 pacientes seropositivos (confirmado con Western blot) que siguieron siendo examinados para participar en ensayos clínicos ... de los 102 pacientes 75 (74%) fueron positivos al ARN del VIH mediante el ensayo ADNb y 61 (60%) fueron positivos mediante en el ensayo de p24 ICD. Solamente un subgrupo de pacientes (n = 56: rango de células CD4, 29-394, mediana 160) fue testeado para viremia en plasma mediante cultivo viral; 34 (61%) fueron positivos al cultivo, mientras 50 (89%) fueron positivos mediante el ensayo ADNb, y 39 (70%) fueron positivos mediante el ensayo de p24 ICD" (239). ¿Cómo es entonces posible afirmar que "prácticamente todas las personas que tienen el ADN del VIH también tienen anticuerpos contra la cepa del VIH de Montagnier" y que "la mayoría, pero ciertamente no todas las personas que carecen de ADN del VIH no tienen tales anticuerpos"?


Conclusión y comentarios

Puesto que Jackson et al no testearon a todos los 409 pacientes ni a todos los 131 individuos negativos para detectar la presencia de "ADN del VIH" utilizando la PCR, sino que testearon solamente a 66 pacientes y un máximo de 43 individuos "negativos de anticuerpos"; no secuenciaron los segmentos amplificados y no determinaron la especificidad de la PCR utilizando el único estardar oro válido, el aislamiento del VIH, no fue posible que reportaran "subconjuntos de ADN específicos del VIH en 403 de los 409 positivos de anticuerpos, pero no en las 131 personas negativas de anticuerpos. Además, Jackson et al reconocieron que su método de PCR no demostró la existencia de un genoma de VIH de longitud completa, sino solamente que "los pacientes de sida, así como los individuos asintomáticos positivos de anticuerpos al VIH-1, albergan material genético del VIH-1". Además, por sus determinaciones de PCR, Jackson et al utilizaron un pequeño fragmento del gen gag como cebador. Pero: (a) puesto que los expertos más conocidos del VIH están de acuerdo en que los genes gag de los retrovirus son homólogos, los resultados de PCR negativos de Jackson et al en todos los 43 individuos "negativos de anticuerpos" quienes al menos deberían haber tenido el retrovirus presente "en todos nosotros", permanece sin explicar; (b) el encontrar un resultado PCR positivo utilizando un pequeño fragmento del gen gag como cebador no prueba la existencia del "genoma del VIH de longitud completa", ni siquiera la existencia de un "gen gag del VIH de longitud completa". Como ya se ha mencionado, en 1989 investigadores del Instituto Pasteur concluyeron que "la tarea de definir la infección de VIH en términos moleculares será difícil". De hecho, ya en 1973, los retrovirólogos fueron conscientes de que la inusual naturaleza de los retrovirus "será un obstáculo para cualquier análisis genético de virus de tumor de ARN" (240). Sin embargo, al menos algunos expertos del VIH, incluyendo Jackson et al, insisten en definir la infección de VIH en términos genéticos. Por otra parte, un análisis de los datos disponibles en la actualidad acerca de los retrovirus muestra que todos los retrovirólogos parecen estar de acuerdo en que el factor más importante para probar la existencia de un retrovirus singular es la existencia de anticuerpos específicos, estando su importancia bien ilustrada por la historia del descubrimiento y posterior desaparición del HL23V (ver 5.4). En lo que se refiere al VIH, es bien sabido que los únicos datos considerados para probar la teoría del VIH del sida es la correlación entre el síndrome clínico y un test de anticuerpos positivo. Menos conocido es el hecho de que en los cuatro artículos publicados en Science en mayo de 1984, Gallo y sus colegas afirmaron que, en contraposición a Montagnier y sus colegas, él y sus colegas lograron un "auténtico aislamiento". Sin embargo, es de fundamental importancia que la única diferencia entre los experimentos realizados por los dos grupos es que el grupo de Gallo empleó una línea celular leucémica a partir de la cual fueron capaces de obtener muchos "antígenos del VIH", y de este modo pudieron desarrollar significativamente más tests de anticuerpos. Teniendo en cuenta que los retrovirólogos están de acuerdo en que los anticuerpos específicos prueban la existencia de un retrovirus singular, y su papel en la patogenicidad, parecería obligatorio probar la especificidad de los anticuerpos. La especificidad de los tests de anticuerpos del VIH solamente puede determinarse mediante el uso del aislamiento del VIH como estándar oro. Hasta el día de hoy esto no se ha realizado, y en la actualidad parece imposible, porque nadie ha cumplido ni siquiera el primer paso del único método científico válido para el aislamiento retroviral, es decir, demostración de micrografías de partículas con las características morfológicas de los retrovirus concentrándose en gradientes de densidad de sacarosa a la densidad de 1,16 g/ml. Además, el "VIH" se puede "aislar" en una minoría de personas que tienen un test de anticuerpos positivo.

Además, como en el caso del HL23V, hay datos de que los anticuerpos presentes en el suero humano que reaccionan con las proteínas del "VIH" tampoco son específicos:
(a) "La mitad del peso molecular de la gp120 está representada por oligosacáridos oligomanosidicos ... Los anticuerpos policlonales a mamano de levadura también reconocen la estructura de carbohidratos de la gp120 del virus del sida" (241);
(b) Los determinantes inmunoquímicos de los factores antigénicos de la Candida albicans muestran una alta identidad con la glicoproteína (gp) 120 del VIH-1: contienen (a1 -> 2) y (a1 -> 3) residuos terminales de manosa enlazados" (242);
(c) los anticuerpos contra los mananos de la Candida albicans "bloquean de infección de células H9 del VIH-1", así como la unión de lectinas a la gp120 (242);
(d) el reconocimiento de la gp120 por anticuerpos a un péptido sintético del mismo antígeno fue "parcialmente suprimido si se absorbió con la fracción total de polisacárido de C. albicans", mientras que el reconocimiento de antígenos por anticuerpos a la "gp120 del virus linfotrópico de células T humano tipo IIB", "fue totalmente bloqueado". De estos datos los autores concluyeron: "Estos resultados indican que los residuos de manano de C. albicans pueden servir como antígenos para generar anticuerpos neutralizantes contra la infección de VIH"; (242)
(e) "el suero humano normal contiene anticuerpos capaces de reconocer la parte de carbohidrato de las glicoproteínas de la envoltura del VIH ... de 100 ml de suero humano se recuperó aproximadamente 200ug de MBIgG [MBIgG=unión de manano IgG] ... el MBIgG se unió a las glicoproteínas de envoltura del VIH gp160, gp120 y gp41" (243);
(f) investigadores de la Universidad de Roma infectaron ratones sanos con un lipopolisacárido de E. coli (LPS) e hicieron reaccionar sus sueros con dos péptidos sintéticos, uno que abarca el bucle gp120 V3 del "MN del VIH-1" y el otro "representando en epítopo inmunodominante de la gp41". Los "ratones tratados con LPS mostraron una reactividad de anticuerpos significativa" con los dos péptidos (V Colizzi et al., comunicación personal)
(g) Kashala, Essex y sus colegas han mostrado que los anticuerpos a carbohidrátos que contienen antígenos tales como el lipoarabinomanano y el glicolípido fenólico, que constituyen la pared celular de la Mycobacterium leprae, una bacteria que "comparte algunos determinantes antigénicos con otras especies de micobacterias" causan "reacciones cruzadas significativas con ls proteínas pol y gag del VIH-1". Esto llevó a los autores a advertir que entre los enfermos de lepra y sus contactos hay una "muy alta tasa de resultados ELISA y WB al VIH-1 falsos positivos", que los resultados del ELISA y el WB deberían interpretarse con precaución al testear individuos infectados la M. tuberculosis o otras especies micobacterianas", y además, que "el ELISA y WB podrían no ser suficientes para el diagnóstico del VIH en zonas endémicas de sida de África central, donde la prevalencia de enfermedades micobacterianas es bastante alto" (244).

No solamente micobacterias (M. leprae, M. tuberculosis, M. avium-intracelular), sino las paredes de todos los hongos (Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum incluyendo Pneumocystis carinni) (245-247), contienen carbohidratos (mananos). El cien por cien de los pacientes de sida (incluso los que "no tienen cándida clínicamente") tienen anticuerpos a la Candida albicans, llevando a los investigadores de los hospitales St. Bartholomews y St. Stephen a afirmar: "Es posible que la candida pueda actuar como un cofactor en el desarrollo patente del sida en individuos infectados con el VIH" (248). También podría ser de interés señalar que en hombres homosexuales el único acto sexual que es un factor de riesgo de seroconversión es el coito anal pasivo (exposición al semen) (249), y que la manosa está presente tanto en el esperma como en el plasma seminal (250). Dado que los anticuerpos a mananos reaccionan con las "proteínas del VIH", entonces, como Essex y sus colegas han señalado en la infección por micobacterias en África, sería de esperar que los sueros de todas las personas infectadas con hongos y micobacterias tuviesen una reacción cruzada con las "glicoproteínas del VIH-1", así como causar "reactividad cruzada significativa con las proteínas pol y gag del VIH-1". Dado el hecho de que los individuos con infecciones de hongos y micobacterias tienen anticuerpos que pueden producir un test de anticuerpos "VIH" positivo, incluso en la ausencia del "VIH", ¿cómo se puede afirmar que:
(a) la PCP, candidiasis, criptococosis, coccidioidomicosis, histoplamosis, tuberculosis o la enfermedad Mycobacterium avium-intracellular, es decir, la gran mayoría de las infecciones oportunistas (88% de casos de sida diagnosticados entre 1988 y 1992 tenían una o más infecciones de hongos o micobacterianas) (251), que significan sida están causadas por el VIH en base de un test de anticuerpos positivo?
(b) que un test de anticuerpos positivo en individuos con infecciones por hongos y micobacterianas prueban la infección por VIH?

Ciertamente, como en el caso del HL23V, ¿es solamente cuestión de tiempo el que los investigadores del VIH acepten que los anticuerpos al VIH no son específicos? Como consecuencia de ello, ¿la recopilación de fenómenos inferidos como prueba de la existencia del virus de inmunodeficiencia humana pasará a la historia como "material completamente no viral"?


Agradecimientos

Nos gustaría expresar nuestro agradecimiento a todos nuestros colegas y especialmente a Bruce Hedland-Thomas, Richard Fox, Livio Mina, Alun Dufty, Barry Page, Andrew Campbell, Jennie Brooks, Gordana Pelemis, Daphne Peters, Gladys Powell, Ron Hirsch, David Dawson, June Rider-Jones, Christine Sibley, al personal del Royal Perth Hospital Library y al personal administrativo del Department of Medical Physics. También expresamos nuestro agradecimiento a Todd Miller, Christine Johnson, Philip Johnson, Harvey Bialy, Charles Thomas, John Lauritsen, Neville Hodgkinson, Gordon Stewart, Huw Christie, James Whitehead, Volker Gildemeister, Michael Baumgartner, Michael Verney Elliot, Joan Shenton, Stefan Lanka, Michael Ristow, Fabio Franchi, Djamel Tahi, Richard and Rosalind Chirimuuta, Udo Schulenk, Brian Peachey, Philip Adams and Hiram Caton. Agradecemos especialmente Peter Duesberg por toda su ayuda y apoyo, y por su ejemplo inspirador de coraje e integridad científica.


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