theperthgroup.com/CONTINUUM/epeondjamel.html
Otra traducción disponible AQUÍ.
Comentarios a la Entrevista a Luc Montagnier
por Eleni Papadopulos-Eleopulos et al.
Continuum Invierno 1997
Queremos agradecer a Djamel Tahi y Huw Christie por pedirnos que comentemos las respuestas dadas por el profesor Luc Montagnier en su entrevista con Djamel Tahi. Antes de comentarlas pensamos que es útil comenzar con una breve revisión de los métodos utilizados para probar la existencia de los retrovirus, y con los datos de Montagnier et al de 1983 acerca de la existencia del "VIH".
Métodos utilizados para probar la existencia de retrovirus
Resumen del artículo de 1983 de Montagnier y sus colegas
Comentarios a las respuestas de Montagnier
Métodos utilizados para probar la existencia de retrovirus
En general se acepta que Peyton Rous descubrió los retrovirus en 1911, cuando consiguió causar malignidades en pollos mediante inyecciones de filtrados libres de células obtenidos de un tumor muscular. Muchos investigadores repitieron experimentos similares, y los fitrados que causaban tumor llegaron a ser conocidos como agentes filtrables, virus filtrables, agentes Rous, virus Rous. Sin embargo, el propio Rous expresó sus dudas de que los agentes que causaban los tumores fueran infecciosos por naturaleza. De hecho, advirtió: "La primera tendencia será considerar el agente autoperpetuo activo en este sarcoma de ave como un organismo parasitario pequeño. La analogía con algunas enfermedades infecciosas de hombres y de animales inferiores, causadas por organismos ultramicroscópicos, da apoyo a esta visión de los descubrimientos, y en la actualidad el trabajo está siendo dirigido hacia su verificación experimental. Pero no debe descartarse un agente de otro tipo. Es concebible que un estimulante químico, elaborado por las células neoplásicas, pueda causar el tumor en otro huesped y provocar en consecuencia una producción adicional del mismo estimulante" (1).
En 1928, A.E. Boycott, el presidente de la Royal Society of Medicine, Sección de Patología, en su discurso presidencial titulado "La transición de la vida a la muerte: la naturaleza de los virus filtrables", dijo: "Otro fenómeno análogo nos lleva, creo, un paso más allá. Los productos de la autolisis de las células muertas en el cuerpo, en la concentración adecuada, estimulan el crecimiento de tejido. Es un hermoso mecanismo autoregulador en el que la cantidad de estímulo es proporcional a la cantidad de destrucción de células, y por tanto a la cantidad de crecimiento celular requerido, y es obviamente de la mayor importancia para la supervivencia, un factor mucho más potente en la selección y evolución que lo haya sido cualquier enfermedad. Puesto que normalmente funciona curando nuestros dedos cortados, el resultado final es simplemente la restauración de las células que fueron destruidas. Pero si la restricción normal ejercida por los tejidos vecinos se evade, y se utilizan cultivos de tejidos, los productos de autolisis o metabolismo (en forma de extractos de tejidos, tumores o embriones) estimulan el crecimiento indefinidamente, y podría obtenerse una cantidad mucho mayor de tejido de con la que comenzamos. De la autolisis de esto puede obtenerse una mayor cantidad de sustancia estimulante, y parece que no hay razón por la cual este proceso de multiplicación debería tener algún límite: los tejidos normales en el aislamiento físico de cultivos de tejido son tan inmortales como los tejidos malignos en su aislamiento fisiológico del resto del cuerpo ... Estos productos de autolisis ... no han recibido tanta atención como se merecen, pero son probablemente de constituciones relativamente simples y reconocibles. Sin embargo, aplicados a las células causan crecimiento, y al hacerlo incrementan potencialmente su propia cantidad; esto es mucho de lo que hace el agente de Rous ... En cuanto a su origen, todos los datos parecen estar de acuerdo en indicar que el virus de Rous surge de novo en cada tumor. No hay datos epidemiológicos de que el cáncer entre en el cuerpo desde el exterior; todo lo que sabemos apoya la visión clásica de que es una enfermedad autóctona local. Se han transmitido mediante filtrados sarcomas experimentales producidos por extracto de embrión e indol, arsénico o alquitrán. Se producen fácilamente epiteliomas en los ratones mediante alquitrán, y en el hombre por irritación crónica; y si creemos que todos los tumores malignos contienen más o menos de un agente cancerígeno semejante al virus de Rous, se deduce que podemos estimular tejidos normales para producir virus con un grado considerable de certeza" (2).
Diez años antes, en un artículo titulado "The Plasmagene Theory of the Origin of Cancer", Darlington, al discutir la inducción de cáncer por el agente de Rous, los virus filtrables y las partículas "autopropagantes" transmitidas por la herencia, pero que se encuentran fuera del núcleo encontrado en plantas y "conocidas como plasmagenes", escribió: "Estas infecciones, se verá que son artificiales, o al menos poco naturales. En la discusión de virus de plantas, la distinción entre infección natural y artificial se conoce desde hace ya mucho tiempo, aunque ha sido poco considerada. Se puede transmitir un número de condiciones aberrantes desde el tronco al vástago, y algunos incluso han surgido en un vástago después de haber sido injertado en un tronco sano. Estas son enfermedades artificiales; no se transmiten por naturaleza, solamente mediante injerto. Algunas podrían haber surgido por la mutación de proteínas autopropagantes en las células de plantas propagadas durante largos periodos mediante medios vegetativos (pueden ser tumores). Otras ciertamente han surgido por la migración o el transplante de las proteínas de un organismo a otro. En cualquiera de los casos, tienen una propiedad de infectar, la cual pueden revelar solamente en circunstancias artificiales ... Cometeríamos un gran error, por tanto, en llamarlos virus; son provirus. Merece la pena contestar a una pregunta más: ¿Qué forma probablemente tomaría la proteína mutante en la célula tumoral? Debido a su rápida multiplicación, bien podría mostrar un mayor grado de agregación que su progenitor. Entonces aparecería como una partícula extraña en la célula mutante. Esto se ve confirmado por las observaciones al microscopio electrónico de dos agentes tumorales de pollo de tipo provirus por Claude, Porter y Pickels (1947)" (3).
La observación de microscopio electrónico de Claude et al constituye el primer informe de partículas con aspecto viral en un tumor, las primeras micrografías electrónicas del "virus de Rous". Poco después, muchos otros investigadores reportaron este tipo de partículas en muchos tumores, y como Boycott predijo, en "tejidos normales estimulados" . En cuanto a la predicción de Darlington de que estas partículas podrían deberse a "un mayor grado de agregación" del citoplasma, puede ser interesante notar que:
(a) para que tenga lugar la agregación de proteínas, ácidos nucléicos o proteínas-ácido nucléico (condensación, contracción), es necesaria la oxidación; (4)
(b) los tejidos de tumor están oxidados;
(c) todos los agentes utilizados para "estimular tejidos normales" para inducir retrovirus son agentes oxidantes (5-7).
En 1940, siguiendo el desarrollo del microscopio electrónico (ME) y la técnica de ultracentrifugación en gradientes de densidad, las partículas observadas en los tejidos malignos pudieron aislarse y por tanto purificarse, es decir, separarse de todo lo demás. Puesto que estas partículas se observaron en tejidos malignos "se ha considerado que las partículas constituyen el agente etiológico de la enfermedad", y para los años 50 a los agentes filtrables de Rous se les conocio como oncovirus (onkos = tumor). La característica morfológica principal de estas partículas es un rango restringido de diámetros, y la característica física principal es su densidad (8). Cuando se determinó la ultraestructura de estas partículas se las definió como partículas con un diámetro de 100-120 nm que contienen "cuerpos internos condensados (núcleos)" y superficies "salpicadas de protuberancias (puntas, botones)" (9).
En la decada de 1950 retrovirólogos bien conocidos, como J.W. Beard, descubrieron que las células, incluyendo las células no infectadas, bajo diversas condiciones, eran responsables de la generación de una serie heterogénea de partículas, algunas de las cuales podrían parecerse a los oncovirus. Este "problema de partícula" llevó a la opinión de que para probar la existencia de un retrovirus, "el esquema de aproximación, como queda bien ilustrado por aquel ideado y rigurosamente probado en las investigaciones de agentes virales, es relativamente simple. Este consiste en:
(1) aislamiento de las partículas de interés;
(2) recuperación (purificación) de las partículas en un determinado preparado, siendo homogéneas con respecto al tipo de partículas;
(3) identificación de las partículas;
(4) análisis y caracterización de las partículas, comprobando si tienen las propiedades físicas, químicas o biológicas deseadas".
Beard también enfatizó que "la identificación, caracterización y análisis están sujetos a disciplinas bien conocidas establecidas por intensas investigaciones, no habiéndose agotado de ninguna manera las posibilidades. Sin embargo, es en este campo donde se ven deficiencias con más frecuencia. Estas están relacionadas en ocasiones con la evasión de disciplinas o con su aplicación a materiales inadecuados. Como estaba previsto, gran parte del interés en los aspectos más tediosos del aislamiento y análisis de partículas se ha desviado hacia los procesos más simples y sin duda informativos de la microscopía electrónica. Aunque se puede aprender rápidamente con el instrumento, sin embargo es claro que los resultados obtenidos con él nunca pueden sustituir, y con mucha frecuencia pueden oscurecer, la necesidad de los análisis fundamentales críticos, que dependen del acceso a materiales homogéneos" (10) (cursiva nuestra).
Los retrovirólogos también están de acuerdo en que "Los viriones de RTV (retrovirus) tienen una densidad de flotación característica, y la técnica preferida para la purificación de RTV es la centrifugación hasta el equilibrio en gradientes de densidad" (11). En una reunión europea sobre el uso de la centrifugación en gradientes de densidad, celebrada en el Instituto Pasteur en 1972, con Jean Claude Chermann como su secretario, se enfatizó que una vez que los fluidos de cultivo (sobrenadantes) se concentran en bandas, la banda de densidad a la que se concentran los retrovirus (esto varía ligeramente con la sustancia utilizada para fabricar los gradientes) debe ser rigurosamente analizada. Los análisis consisten en lo siguiente:
"Análisis de Virus de Tumor de ARN
Físico
Microscopía electrónica
Cuenta de virus
Morfología
Pureza
Bioquímico
Transcriptasa inversa
60-70S ARN, ARN total
Proteína total
Análisis de gel de proteínas virales y de huesped, y ácidos nucléicos
Inmunológico
Difusión de gel
Fijación de complemento*
Inmunofluorescencia*
Biológico
Infectividad in vivoInfectividad in vitro
* Con reactivos específicos para antígenos envueltos e internos gs y env" (12).
(La transcriptasa inversa es una enzima descubierta en primer lugar en los oncovirus en 1970 (13), y de ahí se debe su nombre actual de retrovirus, y 60-70S ARN, el ARN "viral". A los retrovirus en ocasiones se les llama virus de tumor de ARN, porque su genoma consiste de ARN y no de ADN).
De este modo, el método especificado por el Instituto Pasteur en 1972 no es distinto del descrito por J.W. Beard dos décadas antes. De hecho, el método es lógica básica aplicada a la definición de un virus. Es imposible afirmar que una proteína o un ARN son retrovirales a menos que estos sean los constituyentes de una partícula y que la partícula sea infecciosa. Como puede verse, el primer paso es el examen con el microscopio de electrones para probar que la banda contiene partículas con las características morfológicas de los retrovirus y, como Francoise Barre-Sinoussi y Jean Claude Chermann señalaron en la reunión de Pasteur, que la banda es pura, es decir, contiene solamente partículas "sin diferencias aparentes en las apariencias físicas" (14).
El segundo paso en el análisis del material de 1,16 g/ml es probar que las partículas son capaces de retrotranscribir ARN en ADN. Sin embargo, el propio Gallo advirtió que el encontrar partículas, incluyendo aquellas conteniendo transcriptasa inversa, no es suficiente para probar que una partícula es un retrovirus. La prueba completa depende de experimentos para:
(a) obtener partículas de un cultivo que estén separadas de todo lo demás (aisladas), y mostrar que las partículas contienen proteínas y ARN, pero no ADN, y que las proteínas están codificadas por el ARN (el genoma viral);
(b) mostrar que cuando las partículas se introducen en un cultivo de células no infectadas, las partículas penetran en las células y el ARN de las partículas se retrotranscribe en ADN, el cual se incorpora en el ADN de la célula;
(c) mostrar que estas células, a su vez, producen partículas con aspecto retroviral;
(d) mostrar que las partículas producidas por estas células contienen proteínas y ARN que son idénticos a los de las partículas originales introducidas en las células;
(e) mostrar que cultivos de células idénticos a aquellos en que se introdujeron partículas con aspecto retroviral, no producen tales partículas cuando son cultivados con exactamente las mismas condiciones, pero en vez de las partículas retrovirales se introduce cualquier otro material de cultivo, como microvesículas celulares. Esto es debido a que, a diferencia de cualquier otro agente infeccioso, todas las células contienen genomas retrovirales, que podrían expresarse en un cultivo bajo las condiciones apropiadas. Es decir, podría llevar a la aparición de retrovirus conocidos como retrovirus endógenos. De este modo, tanto las células en el cultivo a partir del cual se obtuvieron las partículas originales como el cultivo dentro del cual se introdujeron podrían liberar partículas retrovirales idénticas, incluso si las partículas que se introdujeron no eran infecciosas. Por lo tanto, es absolutamente imprescindible contar con los controles adecuados.
De este modo, para demostrar la existencia de un retrovirus se deben aislar y analizar las partículas con aspecto retroviral dos veces. La primera vez para obtener y analizar los componentes de las partículas liberadas en el primer cultivo. La segunda vez para probar que las partículas liberadas, si las hay, por las célula en el segundo cultivo son idénticas a las partículas iniciales. La advertencia crucial en este prodecimiento es el uso de técnicas experimentales para controlar los efectos de cocultivo, los agentes químicos, y los muchos otros factores que por sí mismos podrían originar fenómenos retrovirales independientes de una infección retroviral exógena (15-17).
En conclusión, a principios de los 80 los retrovirólogos estaban de acuerdo en que para probar la existencia de los retrovirus primero uno debe aislar (purificar) las partículas candidatas, y que el método para lograrlo era la concentración mediante gradiente de densidad.
Resumen del artículo de 1983 de Montagnier y sus colegas
En 1983 Luc Montagnier, y sus colegas del Instituto Pasteur y otros investigadores franceses publicaron un artículo que es considerado como el primer estudio en que se probó la existencia del "VIH". El artículo se titula: "Isolation of a T-Lymphotropic Retrovirus from a patient at risk for Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS)" (18), con Francoise Barre-Sinoussi como autor principal y Jean Claude Chermann como segundo autor. La afirmación de los autores de haber aislado un retrovirus y por tanto haber probado su existencia se basó en los siguientes experimentos:
1. Los linfocitos de los ganglios linfáticos de dos pacientes con linfadenopatía, así como las células mononucleares de sangre periférica de estos pacientes "se pusieron en medio de cultivo con fitohemaglutinina (PHA), factor de crecimiento de células T (TCGF), y antisuero a interferón alfa humano ... En el sistema de ratón, habíamos mostrado previamente que el antisuero a interferón podía incrementar la producción de retrovirus por un factor de 10 a 50". Se sometió a ensayo de modo regular a los sobrenadantes en búsqueda de actividad de transcriptasa inversa (RT), utilizando el cebador-plantilla sintético An.dT12-18. "Después de 15 días de cultivo, se detectó actividad de transcriptasa inversa en el sobrenadante de cultivo del cultivo de ganglio linfático" de uno de los pacientes, el primer paciente (no se indicó el nivel de actividad). "Los linfocitos de sangre periférica cultivados de la misma manera fueron consistentemente negativos en actividad de transcriptasa inversa, incluso tras 6 semanas". Así fueron ambos cultivos del segundo paciente. Aparentemente, la detección de RT fue considerada como prueba de infección con un retrovirus.
2. Los linfocitos de un adulto donante de sangre sano se cultivaron (no se facilitaron las condiciones de cultivo), y después de tres días y medio el cultivo se cocultivó con linfocitos del cultivo del paciente en donde se detectó RT (no se facilitaron las condiciones). "Se pudo detectar actividad de transcriptasa inversa en el día 15 en el sobrenadante de los cocultivos" (no se facilitó el nivel de actividad), pero no se detectó en el cultivo del donante de sangre. No se menciona si las condiciones en el cultivo del donante de sangre eran las mismas que las condiciones del cocultivo. Sin embargo, es obvio que las células del donante de sangre no fueron cocultivadas con linfocitos de ganglios linfáticos de pacientes que no estaban en riesgo de sida, pero que sí tuviesen anormalidades clínicas y de laboratorio similares al paciente número uno. Dado que la cocultivación lleva a la aparición de retrovirus endógenos, esta es una omisión significativa del protocolo experimental.
3. Linfocitos de cordón umbilical normales se cultivaron durante tres días (no se facilitaron las condiciones del cultivo), después de lo cual se añadieron sobrenadantes del cocultivo y polibreno. "Tras un periodo de retraso de 7 días se detectó un título relativamente alto de actividad de transcriptasa inversa". En verdad la actividad fue relativamente baja, de no más de 8.000 cuentas/min. Se ha reportado actividad de fondo tan alta como de 4.000 cuentas/min (19). "Cultivos idénticos" a los que no se había añadido sobrenadante permanecieron negativos. Pero puesto que no se añadió sobrenadante, los cultivos no podían haber sido idénticos. Puesto que el sobrenadante procedente de cultivos no infectados añadido a células no infectadas normales lleva a la aparición de retrovirus endógenos, esta es también una diferencia significativa. Al comentar sobre los hallazgos en los tres experimentos los autores escribieron: "Estas dos infecciones sucesivas muestran claramente que el virus podía propagarse en linfocitos normales de recién nacidos o de adultos". Los datos de los tres experimentos al parecer también se consideraron como prueba de "aislamiento". Sin embargo, "que este nuevo aislamiento era un retrovirus se indicó, además, por su densidad en un gradiente de sacarosa, que fue de 1,16".
4. Los datos de los gradientes de sacarosa consisitieron de dos partes:
(a) el sobrenadante de los linfocitos de sangre de cordón umbilical, en donde se había detectado actividad de RT, fue sometido a gradientes de densidad de sacarosa. La actividad de RT máxima se reportó en la banda de 1,16 g/ml.
(b) al cultivo de linfocito de sangre de cordón en donde se detectó actividad de RT se le añadió [35S] metionina, que es metionina radioactiva, un aminoácido que se incorpora en cadenas de proteínas crecientes y cuya radioactividad permite la detección de tales proteínas. Se realizaron dos tipos de experimentos con este cultivo, uno con las células y el otro con el sobrenadante:
(i) se lisó (se descompuso) un extracto celular, y se centrifugó. Se añadieron dos partes del suero variado de sobrenadante celular (que contiene los anticuerpos), y las proteínas se sometieron a electroforesis (separadas utilizando un campo eléctrico) en un gel de bloque de poliacrilamida-SDS. Se encontró que reaccionaban muchas proteínas, no solamente con los sueros de los dos pacientes con múltiples linfadenopatías, sino también con los sueros de un donante sano y una cabra normal.
(ii) el sobrenadante de cultivo se sometió a gradiente de densidad de sacarosa. Aunque no se hace mención de estudios de ME de la banda de 1,16 g/ml, se afirmó que la banda representaba "virus purificado, etiquetado del paciente 1". La banda de 1,16 g/ml se hizo reaccionar con los sueros de los dos pacientes, así como de dos donantes de sangre sanos, y se procesó de la misma manera que el extracto celular. Aunque en los documentos publicados es prácticamente imposible distinguir proteínas reaccionando con ningún suero, ni siquiera con los sueros de los dos pacientes, en el texto se afirma que "cuando el virus purificado, etiquetado [la banda de 1,16 g/ml] fue analizado [reaccionó con los sueros], se pudieron ver tres proteínas principales: la proteína p25 y proteínas con pesos moleculares de 80.000 y 45.000. La proteína de 45 K puede deberse a contaminación del virus con actina celular, que estaba presente en las inmunoprecipitaciones de todos los extractos de células". (itálica nuestra). Los estudios de ME del cultivo de linfocitos de sangre de cordón "mostró partículas inmaduras características con media luna densa (tipo C) gemando de la membrana plasmática ... El virus es un virus de tumor de ARN tipo C típico".
Comentarios a las respuestas de Montagnier
DT: Un grupo de científicos de Australia sostiene que nadie hasta ahora ha aislado el virus del sida, el VIH. Para ellos las reglas de aislamiento de retrovirus no se han respetado cuidadosamente para el VIH. Estas reglas son: cultivo, purificación del material mediante ultracentrifugación, fotografías de microscopía electrónica (ME) del material que se concentra a la densidad de los retrovirus, caracterización de estas partículas, prueba de la infectividad de las partículas.
LM: No, eso no es aislamiento. Nosotros conseguimos el aislamiento porque "pasamos" el virus, hicimos un cultivo del virus. Por ejemplo, Gallo dijo: "Ellos no aislaron el virus ... y nosotros (Gallo et al), nosotros lo hemos hecho emerger en abundancia en una línea de células inmortal". Pero antes de hacerlo emerger en líneas de células inmortales, nosotros lo hicimos emerger en cultivos de linfocitos normales de un donante de sangre. Ese es el criterio principal. Se tuvo algo que se podía pasar en serie, que se podía mantener. Y caracterizado como un retrovirus no solamente por sus propiedades visuales, sino también bioquímicamente: la actividad de RT (transcriptasa inversa) que es verdaderamente específica de los retrovirus. También tuvimos las reacciones de anticuerpos contra algunas proteínas, probablemente las proteínas internas. Digo probablemente por analogía con el conocimiento de otros retrovirus. No se podía haber aislado este retrovirus sin el conocimiento de otros retrovirus, eso es obvio. Pero creo que hemos respondido a los criterios de aislamiento, totalmente.
1. Si el "cultivo, purificación del material mediante ultracentrifugación, fotografías de microscopía electrónica (ME) del material que se concentra a la densidad de los retrovirus, caracterización de estas partículas, prueba de la infectividad de las partículas" no es aislamiento, entonces ¿por qué Montagnier y sus colegas afirmaron en 1983 haber aislado el "VIH" realizando o bien afirmando haber realizado todos excepto uno (no hubo fotografías del material en banda) de estos procedimientos? ¿Por qué en el artículo de 1984 donde sostuvieron el primer aislamiento del "VIH" en hemofílicos, así como en sus otros estudios de ese año en los cuales tambien sostuvieron el aislamiento del "VIH", ellos realizaron o bien afirmaron haber realizado todos excepto uno de estos pasos? (20-21). ¿Por qué en su estudio titulado "Characterisation of the RNA depended DNA Polymerase of a new human T lymphotropic retrovirus (lymphadenopathy associated virus)"(22) afirmaron que el virus fue "purificado en gradiente de sacarosa utilizando centrifugación isopícnica (8)"? La referencia 8 es al artículo presentado por Sinoussi y Chermann en el simposio de Pasteur de 1972, en el que destacaron la importancia de mostrar que el material en banda contiene nada más que partículas "sin diferencias aparentes en las apariencias físicas" (14).
El hallazgo de algunos o todos los fenómenos que Montagnier señala no son prueba de aislamiento. A estos fenómenos solamente se les puede considerar como prueba de detección viral si, y solo si, son específicos de los retrovirus. La palabra "aislamiento" proviene de la palabra "insulatus" del latín, y significa "hecho en una isla". Se refiere al acto de separar un objeto de toda la materia extraña que no es ese objeto. El objeto de interés aquí es una partícula retroviral. Las palabras "aislamiento" y "pasar" tienen distintos significados. "Aislamiento" significa obtener un objeto, por ejemplo una partícula retroviral, separada de todo lo demás. "Pasar" significa transferir un objeto (que puede o no estar aislado) de un sitio a otro, por ejemplo, de un cultivo a otro. Por lo tanto, incluso si se supone que el "algo" que Montagnier y sus colegas pasaron de un cultivo a otro, por medio de la transferencia de células o de sobrenadantes de cultivo, era un retrovirus, y que fue pasado a un número infinito de cultivos sucesivos, todavía no es prueba de aislamiento. Por ejemplo, si se tiene una serie de botellas conteniendo agua, de las cuales la primera tiene un colorante añadido, se toma entonces parte de la primera y se pone en la segunda, y de la segunda se pasa una muestra dentro de la tercera, y así sucesivamente, este procedimiento claramente no ha aislado el colorante del agua. Un cultivo contiene una cantidad muy grande de cosas, y por tanto por definición no es una prueba de aislamiento de ningún objeto. El único modo posible de afirmar que se ha "hecho un cultivo del virus" es haber tenido pruebas de la existencia del virus antes de hacer el cultivo. Lo único que Montagnier y sus colegas demostraron fue la aparición de actividad de RT en el cocultivo con "linfocitos de un donante de sangre". La detección de una enzima en un cultivo, incluso si es específica a los retrovirus, no es prueba de aislamiento. Por ejemplo, la medición de enzimas cardiacas o hepáticas, en casos de infarto de miocardio o hepatitis respectivamente, no puede ser interpretado como "aislamiento" del corazón o del hígado. El hallazgo en el cultivo de partículas con las características morfológicas de los retrovirus y de actividad de transcriptasa inversa, bien en el cultivo o bien en la banda de 1,16 g/ml, incluso si es "verdaderamente específico de los retrovirus", no es prueba de aislamiento retroviral. Incluso si Montagnier y sus colegas supieran de antemano que algunas de las proteínas presentes en el cultivo o la banda de 1,16 g/ml eran retrovirales, y los pacientes tuviesen anticuerpos retrovirales que reaccionasen con estas proteínas, tal reacción no es prueba de aislamiento. Un razonamiento basado en analogías, o incluso en el conocimiento de otros retrovirus, no puede considerarse como prueba de aislamiento. Por ejemplo, la observación de algo en el océano que se parece a un pez (incluso si es un pez), no es equivalente a tener el pez en tu sartén separado de todo lo demás que ocurre en el océano.
3. Estamos de acuerdo con Gallo en que Montagnier et al no presentaron pruebas de "verdadero aislamiento" de un retrovirus, cualquier retrovirus, ya sea viejo o nuevo, exógeno o endógeno.
4. El "conocimiento de otros retrovirus" demuestra que no todas las partículas con actividad de RT y con "propiedades visuales de los retrovirus" son virus. Este es un hecho reconocido incluso por Gallo mucho antes de la era del sida (23). También demuestra que la RT no es "verdaderamente específica de los retrovirus". Las células no infectadas, así como las bacterias y los virus distintos a los retrovirus tienen RT. Según algunos de los más conocidos retrovirólogos, incluyendo a sus descubridores, así como el premio Nobel y director del US National Institutes of Health, Harold Varmus, las transcriptasas inversas están presentes en todas las células, incluyendo las bacterias (13, 24-25). Además, la actividad de RT se ha reportado en muchas de las líneas de celulas a partir de las cuales se ha "aislado" el "VIH", incluyendo la H9 y la CEM, así como linfocitos normales, incluso cuando no están infectados con el "VIH" (26-27). Los propios Montagnier, Barre-Sinoussi y Chermann han mostrado que la actividad de RT no es específica a los retrovirus. En su artículo de 1972, Barre-Sinoussi y Chermann escribieron: "Hubo actividad significativa en la zona de muestra y el pico de sedimentación más rápido, que consiste principalmente en restos de células. Esta actividad enzimática se puede explicar por la presencia de algunas partículas de virus en estas regiones y, puesto que se ha encontrado actividad de polimerasa similar en células normales, puede atribuirse principalmente a la enzima celular". En esta entrevista, en la respuesta a la pregunta 14, Luc Montagnier dice: "Por ejemplo, un día tuve un pico muy bueno de RT, que me dio F. Barre-Sinoussi, con una densidad un poco más alta, 1,19. ¡La comprobé! , era un micoplasma, no un retrovirus". ¿Cómo es entonces posible que Montagnier diga que la RT es específica a los retrovirus? Estamos de acuerdo en que la actividad de RT es una característica de los retrovirus. Sin embargo, "especificidad" no tiene el mismo significado que "característica". El pelo es característico de los seres humanos, pero no todo animal con pelo es un humano.
5. Aislamiento significa obtener un objeto separado de todo lo demás. Los retrovirus son partículas y ninguna "analogía" puede probar que se ha aislado una partícula retroviral. "El conocimiento de otros retrovirus" puede ser de ayuda en la elección del mejor método para obtener el aislamiento. El "conocimiento de otros retrovirus" muestra que el mejor, pero de ninguna manera el método perfecto para aislar y probar la existencia de un retrovirus, es el consistente en realizar bandas isopícnicas (densidad idéntica de partícula y porción del gradiente), y realizar todos los análisis especificados en el simposio de Pasteur de 1972. El "conocimiento de otros retrovirus" también muestra que no hay nada específico en la morfología de las partículas retrovirales, las reacciones proteína-anticuerpo, o incluso la concentración a la densidad de 1,16 g/ml mediante gradientes de densidad de sacarosa. Las partículas retrovirales se concentran a la densidad de 1,16 g/ml, pero no todo a esa densidad, incluyendo a las partículas con la morfología de las partículas retrovirales, es un retrovirus (11-13, 28). Para recordar que esto es así, hay solamente que considerar el "primer" retrovirus humano, el "HL23V".
A mediados de los 70, Gallo y sus colegas reportaron el aislamiento del primer retrovirus humano. De hecho, los datos acerca del aislamiento del "HL23V" superaban a los del Montagnier et al y cualquier otro para el "VIH" en al menos tres importantes aspectos. A diferencia del "VIH", en el caso del "HL23V" el grupo de Gallo:
(a) informó de la detección de actividad de RT en leucocitos frescos, sin cultivar;
(b) no necesitaron estimular sus cultivos de células con varios agentes (tanto Montagnier como Gallo admiten que ninguno de los fenómenos que dicen que demuestran la existencia del "VIH" pueden detectarse a menos que los cultivos sean estimulados por varios agentes);
(c) publicaron una micrografía electrónica de partículas con aspecto viral concentradas a una densidad de sacarosa de 1,16 g/ml (23-29).
Sin embargo, hoy nadie, ni siquiera Gallo, considera al "HL23V" como el primer retrovirus humano, ni siquiera un retrovirus (para una discusión más detallada ver Papadopulos-Eleopulos et al (30-32)). Tampoco hay que olvidar el siguiente conocimiento adicional en relación con los retrovirus:
(a) la lección de la enzima adenosina trifosfato. Como la RT, esta enzima se consideraba que era específica a los retrovirus, y por lo menos en los años 50 fue utilizada no solamente para su detección y caracterización, sino también para su cuantificación (8-11). Sin embargo, en la actualidad se acepta que esta es una de las enzimas más ampliamente difundidas.
(b) un mucho mayor porcentaje de sueros de pacientes de sida y aquellos en riesgo reaccionan con proteínas de retrovirus endógenos que los sueros de personas sanas, 70% frente a 3% (33).
DT: Déjeme volver a las reglas de aislamiento de retrovirus, que son: cultivo, purificación a la densidad de los retrovirus, fotografías de ME del material a la densidad de los retrovirus, caracterización de las partículas, prueba de la infectividad de las partículas. ¿Se han hecho todos estos pasos para el aislamiento del VIH? Me gustaría añadir que, según varias referencias publicadas citadas por el grupo de Australia, la RT no es específica a los retrovirus y, además, el trabajo de ustedes para detectar RT no se hizo en el material purificado.
LM: Creo que publicamos en Science (Mayo 1983) un gradiente que mostraba que la RT tenía exactamente la densidad de 1,16 g/ml. Así que se tenía un pico que era RT. Por tanto, se ha cumplido este criterio de purificación. Pero pasarlo en serie es difícil porque, cuando se pone el material a purificar, en un gradiente, los retrovirus son muy frágiles, por lo que se rompen entre sí y pierden en gran medida su infectividad. Pero pienso que aún así fuimos capaces de mantener un poco de su infectividad. Pero no fue tan fácil a como se hace hoy en día, porque las cantidades de virus eran, no obstante, muy débiles. Al principio nos encontramos con un virus que no mataba a las células. El virus procedía de un paciente asintomático, y se clasificó entre los virus no formadores de sicintios, no citopatógenos utilizando el coreceptor ccr5. Fue el primer virus de BRU. Se tenía muy poco de él, y no se podía pasar en una línea de células inmortal. Lo intentamos durante algunos meses, no tuvimos éxito. Tuvimos éxito muy fácilmente con la segunda cepa. Pero ahí está el muy misterioso problema de la contanimación de esa segunda cepa por la primera. Eso fue LAI.
1. Es cierto que Montagnier y sus colegas hallaron un pico de actividad de RT a la densidad de 1,16 g/ml. Sin embargo, el hallar este pico no prueba que la banda estuviese formada de partículas retrovirales, puras o impuras. Por tanto, con este dato no se puede considerar que "se ha cumplido este criterio de purificación".
2. En el mismo número de Science donde Montagnier y sus colegas publicaron su estudio, Gallo señaló que "la envoltura viral que se requiere para la infectividad es muy frágil, tiende a desprenderse cuando el virus gema de las células infectadas, dejando así a las partículas incapaces de infectar a nuevas células". Debido a esto Gallo afirmó que "podría ser necesario el contacto célula a célula para la infección retroviral" (34). En la actualidad, todos los expertos del "VIH" están de acuerdo en que para la infectividad del "VIH" es absolutamente necesaria la gp120. En 1993 el propio Montagnier dijo que para que las partículas de "VIH" sean infecciosas, estas primero deben unirse al receptor CD4 celular, y que "La gp120 es responsable de la unión al receptor CD4" (35-36). Sin embargo, hasta la fecha nadie ha publicado ninguna ME de partículas libres de células que tengan la dimensión de las partículas retrovirales y también botones o puntas, es decir la gp120, ni siquiera Hans Gelderblom y sus colegas del Instituto Koch de Berlín, que han llevado a cabo los estudios más detallados de microscopía electrónica de las partículas presentes en cultivos-cocultivos que contienen tejidos derivados de pacientes de sida. En una de sus últimas publicaciones, donde se discute este asunto, estiman que inmediatamente después de ser liberadas, las "partículas de VIH" poseen un promedio de 0,5 botones por partícula, pero también señalan que "era posible que pudieran observarse estructuras semejantes a los botones incluso cuando no hubiese gp120, es decir, falsos positivos" (37).
Esto significa que ni Montagnier y sus colegas ni nadie más posteriormente pudieron infectar los cultivos con células de donantes sanos, linfocitos de cordón umbilical, o cualquier otro cultivo con el "VIH purificado", o incluso los fluidos libres de células (el sobrenadante del cultivo), incluso si el virus "purificado" contenía solamente partículas. En otras palabras, es imposible que Montagnier y sus colegas hayan tenido ninguna infectividad, ni siquiera "una poca", ni con el sobrenadante del cultivo ni con el "virus purificado, etiquetado". Por la misma razón, la "segunda cepa" no pudo contaminarse con "la primera". Además, puesto que Montagnier et al proporcionaron a Gallo sobrenadantes libres de células, habría sido imposible que los cultivos de Gallo estuviesen contaminados con BRU, LAI o una mezcla.
3. El virus de Montagnier no procedió "de un paciente asintomático", sino de un paciente con "linfadenopatía y astenia". Ni en su estudio ni siquiera hoy, después de casi quince años del "VIH", hay pruebas de la existencia de un retrovirus humano que tenga la capacidad de "matar células". El estudio que en la actualidad es más a menudo citado como prueba de que el "VIH" mata a las células T4, considerado como el "sello distintivo" del sida, fue publicado en 1984 por Montagnier y sus colegas. Cultivaron células CD4+ (T4) prodecentes de un paciente hemofílico que era "un portador de virus asintomático", "en presencia de fitohemaglutinina (PHA), seguido de IL-2". Detectaron en el cultivo actividad de RT, y "partículas virales caracterizadas por un pequeño núcleo excéntrico". El número de células T4 (CD4+) en el cultivo se midió contando el número de células capaces de unirse a un anticuerpo monoclonal, que se afirmaba que era específico de la proteína CD4. El número de células que fueron capaces de hacer eso disminuyó con el tiempo. Discutiendo su hallazgo escribieron: "Este fenómeno intrigante puede deberse a la modulación inducida por el virus en la membrana celular, o por el impedimento estérico del sitio de unión del anticuerpo", es decir, la disminución no se debe a la muerte celular (38-39).
Dados sus datos, la conclusión de que la disminución de las células T4 no es debido a la muerte celular no es sorprendente. Sin embargo, su conclusión de que el efecto puede ser inducido por el "virus" es sorprendente. Montagnier y sus colegas conocían los datos experimentales que mostraban que, bajo ciertas condiciones (incluyendo la exposición a PHA, IL-2 y otros agentes oxidantes), aparece una disminución en las células T4 en ausencia del VIH. En este tipo de cultivo, las células T pierden su marcador CD4 y adquieren otros marcadores, incluyendo el CD8, mientras que el número total de células T permanece constante (40-43). Además, tenían pruebas de que en "las células infectadas, este fenómeno no se puede detectar a menos que el cultivo sea estimulado con sustancias como el PHA o antígenos (proteínas como las proteínas "que no son del VIH" presentes en los cultivos "infectados"(39) ). Teniendo en cuenta los hechos anteriores, es incluso más sorprendente que Montagnier y sus colegas no utilizasen controles, es decir, cultivos de células T4 procedentes de pacientes que no estaban en riesgo de sida, pero que sin embargo estaban enfermos, y a los que se habría añadido PHA y IL-2. Estos experimentos sí fueron reportados por Gallo y sus colegas en 1986. Presentaron datos sobre tres cultivos de células que contenían un 34% de células CD4 al principio: un cultivo fue "infectado" y estimulado con PHA, el segundo no fue infectado pero sí fue estimulado con PHA, y el tercero no fue ni infectado ni estimulado. Tras dos días de cultivo, la proporción de células CD4+ en los cultivos estimulado-no infectado y estimulado-infectado fue de 30% y 28% respectivamente, mientras que a los 6 días el número fue 10% y 3%. El número de células CD4+ no cambió significativamente en el cultivo no infectado no estimulado (44).
Para 1991 Montagnier y sus colegas habían realizado experimentos con células no infectadas y no estimuladas al estudiar la apoptosis causada por el "VIH", que se ha dicho (y todavía muchos siguen diciendo) que es el mecanismo principal mediante el cual el "VIH" mata a las células. Mostraron que en cultivos de células CEM "infectados con el VIH" de modo agudo, en presencia de agente de eliminación de micoplasma, la muerte celular (apoptosis) es máxima 6-7 días después de la infección, "mientras que la producción de virus máxima ocurrió en los días 10-17", es decir, el efecto máximo precedió a la causa máxima. En células CEM crónicamente "infectadas" y en la línea celular de monocitos U937 no se detectó apoptosis, aunque "estas células produjeron virus infeccioso continuamente". En linfocitos CD4 aislados a partir de un donante normal, estimulados con PHA e "infectados con el VIH" en la presencia de IL-2, la apoptosis llegó a ser detectable 3 días después de la infección, y evidente a los 4 días. "Curiosamente, al quinto día" la apoptosis llegó a ser detectable en células estimuladas con PHA "no infectadas". Concluyeron: "Estos resultados demuestran que la infección por VIH de células mononucleares de sangre periférica conduce a la apoptosis, un mecanismo que podría ocurrir también en la ausencia de infección debido al tratamiento mitógeno de estas células (45). En conclusión, todos los datos disponibles en la actualidad muestran que la "infección por VIH", en ausencia de agentes estimulantes, ni disminuye el número de células T4 ni induce apoptosis, mientras que los agentes estimulantes (similares a los que están expuestos los pacientes en riesgo de desarrollar sida) sí lo hacen en ausencia del "VIH". Es decir, ni el "VIH" que Montagnier y sus colegas se encontraron en un principio, ni ningún otro "VIH" desde entonces, ha demostrado que "mate a las células".
DT: ¿Por qué las fotografías de ME publicadas por ustedes provienen del cultivo y no de la purificación?
LM: Había tan poca producción de virus que era imposible ver lo que podría haber en un concentrado de virus mediante un gradiente. No había suficiente virus para hacer eso. Por supuesto se intentó, se buscó en los tejidos del comienzo, así como en la biopsia. Vimos algunas partículas, pero no tenían la morfología típica de los retrovirus. Eran muy distintas, relativamente distintas. Con el cultivo llevó muchas horas encontrar las primeras imágenes. ¡Fue un esfuerzo romano! Es fácil criticarlo después de hecho. Lo que no tuvimos, y siempre lo he reconocido, fue que realmente fuera la causa del sida.
Los retrovirus no son conceptos esotéricos, nucleares o cosmológicos cuya existencia solamente pueda inferirse mediante observaciones indirectas. Son partículas que pueden verse, aunque no a simple vista. Puesto que Montagnier y sus colegas admiten que no vieron partículas con la morfología de los retrovirus en la banda 1,16 g/ml , afirmar la presencia de un retrovirus, e incluso de un "virus purificado", no tiene ningún fundamento y resulta increíble. La banda de 1,16 g/ml se puede comparar a una red de pesca. La diferencia es que la banda atrapa objetos de acuerdo con su densidad, no con su tamaño. Imagínese un pescador que ve muchos objetos distintos en el océano, algunos de los cuales pueden pescarse. Lanza la red, espera, y al retirar la red lleva a cabo un examen exhaustivo de su contenido, mostrando que contiene muchas criaturas marinas, pero nada que se parezca a un pez. Sin embargo, por extraño que pueda parecer, afirma haber capturado un pez. De hecho afirma que la red no tiene nada más que pescado puro.
DT: ¿Cómo es posible, sin fotografías de ME de la purificación, saber si estas partículas son virales y tienen que ver con un retrovirus, menos aún un retrovirus específico?
LM: Bueno, estaban las fotos de las gemaciones. Publicamos imágenes de gemación que son características de los retrovirus. Dicho esto, decir que de solamente la morfología no se podía afirmar que era realmente un retrovirus. Por ejemplo, un especialista frances de ME's de retrovirus me atacó publicamente diciendo: "Esto no es un retrovirus, es un arenavirus", porque hay otras familias de virus que geman y tienen puntas en la superficie, etc.
Aunque la gemación de la membrana celular es el modo en el que aparecen las partículas retrovirales, este proceso no es específico de los retrovirus. En otras palabras, solamente porque una partícula geme y tenga las características morfológicas de las partículas retrovirales no prueba que sea un retrovirus. Que este es el caso puede ilustrarse mediante dos hechos, y citando a dos de los retrovirólogos mejor conocidos: se han encontrado "partículas con aspecto viral en gemación" en las líneas de células T CEM, H9 y C8166 no infectadas; "en 2 líneas de líneas de células B transformadas EBV; y en cultivos de células linfoides humanas primarias de sangre de cordón, que fueron bien estimulados o no con PHA y crecidos con o sin sueros, y directamente en linfocitos de cordón tras separación Ficol (46)" (cursiva nuestra). Tras un extenso estudio in vivo realizado por O'Hara y sus colegas de Harvard, las "partículas de VIH" se encontraron en 18/20 (90%) de pacientes con ganglios linfáticos agrandados atribuidos al sida. Sin embargo, también se encontraron partículas idénticas en 13/15 (87%) de pacientes con ganglios linfáticos agrandados no atribuidos al sida y sin riesgo de desarrollar sida. Estos datos llevaron a los autores a la conclusión de que "La presencia de tales partículas no indican, por sí solas, la infección con el VIH" (47).
En 1986, Gallo y sus colegas, discutiendo el "Primer aislamiento del HTLV-III" escribieron: "En el momento en que obtuvimos el LAV, varios expertos en morfología de virus afirmaron que las partículas mostradas en la micrografía electrónica, publicadas en Science por Barre-Sinoussi et a, eran un arenavirus ... Puesto que consideramos la mera detección de partículas de virus en cultivos de pacientes de sida y ARC, insuficiente para confirmar científicamente nuestra hipótesis de que tales partículas estuviesen implicadas en la etiología de la enfermedad, decidimos primero obtener reactivos específicos contra el nuevo virus, con el fin de publicar resultados definitivos relativos a la etiología del sida" (48). Según Peter Duesberg, las partículas y proteínas de "VIH" podrían reflejar material completamente no viral" (49).
DT: ¿Por qué esta confusión? ¿Las fotografías de ME no mostraron claramente un retrovirus?
LM: En este periodo los retrovirus más conocidos eran los de tipo C, que eran muy típicos. Este retrovirus no era un tipo C, y los lentivirus eran poco conocidos. Yo mismo lo reconocí mirando fotografías del virus de anemia infecciosa equina en la biblioteca, y mas tarde del virus Visna. Pero repito, no fue solamente la morfología y las gemaciones, hubo RT ... fue el conjunto de estas propiedades lo que me hizo decir que era un retrovirus.
En su estudio Montagnier y sus colegas escribieron: "La microscopía electrónica de los linfocitos de cordón umbilical infectados mostró partículas inmaduras características con media luna densa (tipo C), gemando de la membrana plasmática ... Este virus es un virus de tumor de ARN tipo C típico". En 1984 Montagnier, Barre-Sinoussi y Chermann reportaron que su virus era "morfológicamente similar a partículas D, tales como aquellas encontradas en el virus Mason-Pfizer, o el virus recientemente aislado a partir del sida de simios" (38). (Para 1984, investigadores de los centros de investigación con primates de los Estados Unidos afirmaron la existencia del sida en monos, y que la causa del sida era un retrovirus tipo D similar al virus Mason-Pfizer, un retrovirus tipo D típico, y sugirieron que el sida de mono y estos retrovirus podrían ser útiles en el estudio del sida humano y el "VIH").
En el mismo año, en otra publicación, Montagnier et al afirmaron que las partículas de "VIH" tenían "morfología similar a la de los virus de anemia infecciosa equina (EIAV), y las partículas de tipo D". El EIAV y el virus visna no son retrovirus tipo C ni tipo D, sino que son lentivirus, es decir, virus que tienen una morfología totalmente distinta, y que se dice que causan enfermedades mucho tiempo después de la infección (en el momento en que se publicó este artículo se descubrió que los pacientes que tenían un test de anticuerpos positivo al "VIH" no desarrollaban el sida inmediatamente, es decir, había un retraso entre un test positivo y la aparición del sida). Es más sorprendente que la morfología de un mismo virus sea capaz de cambiar de género desde una partícula tipo C típica a una partícula tipo D típica, y luego a una subfamilia completamente diferente, la de un lentivirus típico, aparentemente a voluntad. La familia Retroviridae se divide en tres subfamilias: Oncovirinae, Lentivirinae and Spumavirinae. La Oncovirinae se divide a su vez en géneros de partículas tipos B, C y D. Estos hallazgos son análogos a describir una nueva especie de mamífero como un humano, un gorila y un orangután.
DT: Acerca de la RT, se detecta en el cultivo. Luego está la purificación, donde se encuentran las partículas retrovirales. Pero a esta densidad hay muchos otros elementos, entre estos los que se llaman "con aspecto viral".
LM: Exactamente, exactamente. Si lo prefieres, no fue una propiedad sino el conjunto de las propiedades el que nos hizo decir que era un retrovirus de la familia de los lentivirus. Tomadas de forma aislada, cada una de las propiedades no es verdaderamente específica, pero sí el conjunto de todas ellas. Así que tuvimos: la densidad, la RT, las fotos de la gemación, y la analogía con el virus visna. Esas son las cuatro características.
1. Además de los retrovirus, otras partículas pueden tener "el conjunto de propiedades" (la densidad, la RT, la gemación, y la analogía con el virus visna). Se deduce que la detección de partículas que tienen este "conjunto de propiedades" no prueba que las partículas detectadas son retrovirus. De hecho, Montagnier y sus colegas no reportaron la detección de partículas de "VIH" con este "conjunto de propiedades". Puesto que Montagnier y sus colegas no pudieron encontrar partículas con las características morfológicas de los retrovirus a la densidad de 1,16 g/ml, incluso tras un "esfuerzo romano", se sigue que los datos a favor de la existencia del "VIH" a partir del gradiente de densidad no solamente eran no específicos, sino que eran inexistentes (este hecho por sí solo es suficiente para desestimar cualquier afirmación de haberse probado la existencia de un retrovirus, no importa lo que encontraran en cualquier otra parte, incluyendo las partículas en gemación en la superficie celular, partículas con aspecto retroviral en el cultivo, RT en la "densidad", o proteínas en la misma densidad que reaccionan con los sueros de los pacientes).
2. Es cierto que Montagnier et al reportaron actividad de RT a la densidad de de 1,16 g/ml, pero puesto que:
(a) Barre-Sinoussi y Chermann aceptan que las células y los fragmentos celulares también tienen actividad de RT;
(b) en la banda de 1,16 g/ml no se vio ninguna partícula con la características morfológicas de los retrovirus;
(c) a esa densidad Montagnier et al encontraron fragmentos celulares,
se deduce que los datos de la existencia del "VIH" por la detección de actividad de RT a esa densidad no solamente eran no específicos, sino inexistentes.
Teniendo en cuenta que:
(a) hay diferencias significativas en la naturaleza de los procesos de gemaciones entre las partículas tipo C, tipo D y los lentivirus (50), y en 1983 Montagnier et al reportaron su retrovirus como tipo C, y en 1984 como tipo C o tipo D, e incluso más tarde ese año como EIAV;
(b) el virus visna y el EIAV son lentivirus,
se deduce que al menos hasta mediados de 1984 los datos de Montagnier et al relativos a la existencia del "VIH" (si el "VIH" es un lentivirus), a partir de las "fotos de gemación" y la analogía con el EIAV y el visna virus, no solamente eran no específicos, sino inexistentes.
DT: Pero ¿cómo todos estos elementos prueban que es un nuevo retrovirus? ¿algunos de estos elementos podían tener que ver con otras cosas, con "aspecto viral"?
LM: Sí, y es más, tenemos retrovirus endógenos que a veces expresan partículas, pero de origen endógeno, y que por tanto no tienen un papel patológico, en ningún caso en el sida.
Estamos de acuerdo en que hay retrovirus endógenos (pero es de interés que hasta 1994 "no hay retrovirus endógenos humanos conocidos" (51)). Estos retrovirus endógenos no pueden distinguirse de los retrovirus exógenos ni morfológicamente ni químicamente. Además, existen datos que muestran que el 70% de los pacientes de sida y aquellos en riesgo, en comparación con el 3% de las personas sin riesgo, tienen anticuerpos a retrovirus endógenos (33). Dados estos hechos, y las condiciones de cultivo que Montagnier y sus colegas, y todos los demás investigadores del "VIH", utilizan para detectar el "VIH", junto con los datos actualmente disponibles del "VIH" y el sida, es más probable que el "VIH" (si se demuestra que existe) sea un retrovirus endógeno más que un retrovirus exógeno.
Parte de los datos relativos a las condiciones del cultivo se pueden resumir de la siguiente manera: en cultivo, las células tarde o temprano comienzan a liberar retrovirus endógenos. La aparición de retrovirus endógenos puede acelerarse, y el rendimiento incrementarse hasta un millón de veces, mediante la estimulación del cultivo con mitógenos, la cocultivación, o mediante la adición al sobrenadante del cultivo de cultivos de células normales, no estimulados. Ciertamente, ya en 1976 los retrovirólogos reconocieron que "el fracaso en aislar virus endógenos de ciertas especies podría reflejar las limitaciones de las técnicas de cocultivación in vitro" (52). Para detectar el "conjunto" de las "cuatro características" del "VIH", Montagnier et al (así como todos los demás) emplearon al menos dos de las técnicas anteriores. De hecho, tanto Montagnier como Gallo admiten que ninguna de las cuatro "características" puede detectarse a menos que se estimulen los cultivos. Del mismo modo, parte de los datos relacionados con el "VIH" y el sida se pueden resumir como sigue:
(a) Es cierto que los retrovirus endógenos podrían no tener ningún papel patológico en el sida, pero también es verdad que, hasta la fecha, tampoco hay tal prueba para el "VIH" (53). Según Montagnier y Gallo el "sello distintivo" de la inmunodeficiencia en el sida es la disminución de células T4, que se dice es el resultado de que el "VIH" mate a las T4. Sin embargo, Montagnier y sus colegas admitieron ya en 1984 que, al menos in vitro, la disminución observada de las células T4 tras la infección por "VIH" no se debe a la muerte celular, sino a una disminución de la unión del anticuerpo T4 (CD4) a las células. Dos años después, los experimentos del equipo de Gallo probaron, sin ninguna duda, que la disminución de las células T4 (de la unión del anticuerpo CD4) no se debía a la infección por "VIH", sino a la PHA, que estaba presente en la preparación de "VIH". Como se ha mencionado, en el comienzo de la era del sida había muchos datos que mostraban que el tratamiento de los cultivos de células con PHA y otros agentes oxidantes llevaba a una unión decrementada del anticuerpo CD4, y a una unión incrementada del anticuerpo CD8, es decir, una dismimución de las células T4 se acompañaba por un aumento de las células T8, mientras que el número total permanecía constante. Los pacientes de sida y los individuos que pertenecen a los grupos de riesgo del sida están continuamente expuestos a fuertes agentes oxidantes. En la actualidad se acepta que tanto en los pacientes de sida como en aquellos en riesgo, la disminución de las células T4 se acompaña por un aumento en las T8, mientras que el número de células T4 + T8 permanece constante (53). También es de interés señalar que, ya en 1985, Montagnier escribió: este síndrome [el sida] sucede en una minoría de las personas infectadas, que generalmente tienen en común un pasado de estimulación antigénica y de depresión inmune anterior a la infección por LAV" (54), es decir, Montagnier reconoció que en el grupo de riesgo del sida, la deficiencia inmune precede a la infección por el "VIH". En 1984 Montagnier y sus colegas, incluyendo a Barre-Sinoussi y Chermann, afirmaron que "las pruebas definitivas requerirán un modelo animal, en el que tales virus [LAV, HTLV-III = VIH], causaran una enfermedad similar al sida". Hasta el día de hoy no existe tal modelo. Sin embargo, cuando Montagnier fue perseguido por el premio Nobel Kary Mullis para que le mostrara cualquier artículo científico que pruebe la teoría del VIH del sida, Montagnier le aconsejó: "¿por qué no citas el trabajo del SIV?" (virus de inmunodeficiencia del simio) (55);
(b) A diferencia de los retrovirus endógenos, que se transmiten verticalmente, se dice que el "VIH" se transmite horizontalmente, especialmente mediante relaciones sexuales. De hecho, en la actualidad se acepta generalmente que la gran mayoría de personas infectadas lo han sido a través de contacto heterosexual. Según Montagnier y Gallo, el primer estudio que demostró fuera de duda que el "VIH" es un virus transmitido por vía heterosexual de modo bidireccional, se publicó en 1985 por Redfield et al. Sin embargo, en un libro publicado en 1990 titulado "Sida y sexo", sus editores, Bruce Voeller, June Machover Reinisch y Michael Gottlieb, al discutir este estudio transversal, así como otros estudios similares, escribieron: "los investigadores del gobierno publicaron datos que indican que el personal de las fuerzas armadas de los Estados Unidos infectado con el VIH-1, había contraído el virus de prostitutas, lo que aumentó las llamadas a favor de incrementar las campañas contra la prostitución. Cuando los soldados infectados fueron entrevistados por investigadores no militares en quienes confiaron, se hizo evidente que casi todos habían sido infectados por el uso de drogas intravenosas o contacto homosexual, actos por los cuales podían ser expulsados de las fuerzas armadas, lo cual les impedían ser sinceros con los investigadores militares originales. En cada uno de estos estudios defectuosos publicados, los investigadores, los editores de revistas y los revisores no lograron corregir los errores que deberían haber sido identificados".
Nancy Padian, del departamento de epidemiología y bioestadística de la Universidad de California, y sus colegas, que han llevado a cabo los estudios más completos hasta la fecha sobre transmisión heterosexual, discutiendo el estudio de Redfield's et al, así como otros estudios que afrman haber probado tales transmisiones, escribieron en 1991: Estos "estudios podrían no haber controlado adecuadamente otras vías no sexuales de transmisión, como los riesgos asociados con el uso de drogas intravenosas. A primera vista, los casos que aparecen atribuidos a una transmisión heterosexual podrían, después de una entrevista en profundidad, realmente estar relacionados con otras fuentes de riesgo ... puesto que los estudios asociados no son, por definición, muestras aleatorias, y los resultados más reportados se basan en análisis retrospectivos o transversales, algunos estudios podrían seleccionar más de lo debido parejas en las que ambos compañeros están infectados, porque estas parejas podrían ser identificadas más fácilmente, sesgando así las tasas de transmisión. Además, a menudo es difícil establecer la fuente de la infección en estas parejas. Cuando pocos datos prospectivos están disponibles, el inscribir a parejas monógamas en donde se desconoce el estado serológico de la pareja, como fue el caso de la mayoría de parejas en este estudio, es una de las únicas maneras de controlar este sesgo" (56). En efecto, de los estudios prospectivos, de los pocos que hay, no hay pruebas de que el "VIH" se transmita sexualmente (57-58).
En su estudio de diez años, sin duda el más largo y el mejor estudio de su tipo, Padian (59) y sus colegas no escatimaron esfuerzos en intentar demostrar que el "VIH" se transmite por vía heterosexual. Hubo dos partes en su estudio, una transversal y la otra prospectiva. En la primera, de 360 parejas femeninas de casos índice masculinos infectados, "Se estimo que la constante de infectividad por contacto para la transmisión hombre a mujer era de 0,0009". Los factores de riesgo de seroconversión fueron:
(i) el coito anal (el propio Montagnier demostró que un test de anticuerpos positivo revierte a negativo, y una cuenta de células T4 baja a una normal, mediante la detención del coito anal, lo que significa que el resultado positivo no se debe a un retrovirus (60));
(ii) el tener compañeros que adquirieron esta infección a traves del consumo de drogas (la propia Padian dice que esto significa que las mujeres también podrían ser consumidores de drogas IV);
(iii) la presencia en las mujeres de enfermedades de transmisión sexual (los anticuerpos contra sus agentes causales podrían tener reacciones cruzadas con las proteínas del "VIH" (31)).
De 82 parejas masculinas negativas de casos de índice femeninos positivos, solamente dos seroconvirtieron. Estimaron que la probabilidad de transmisión de mujer a hombre era 8 veces menor que la de hombre a mujer. La propia Padian dudó de la validez de estos dos casos. Para el primero dio varias razones en 1991, cuando se informó de este caso por primera vez. En el segundo caso mencionaron el hecho de que "es sorprendente que la clamidia se transmitió simultáneamente o cerca a la transmisión del VIH", es decir, que el test de anticuerpos positivo al "VIH" apareció cuando resultó infectado con clamidia".
En el estudio prospectivo, que comenzó en 1990, "Seguimos a 175 parejas serodiscordantes al VIH a lo largo del tiempo, para un total de aproximadamente 282 años-pareja de seguimiento ... La mayor duración del seguimiento fue de 12 visitas (6 años). No se observaron seroconversiones tras entrar en el estudio ... En el último seguimiento, las parejas eran mucho más propensas a la abstinencia o a usar siempre condones ... Sin embargo, solamente un 75% reportó un uso consistente del condón en los 6 meses anteriores a su visita final de seguimiento". Nota: la seroconversión no solamente se reportó únicamente en el estudio transversal, sino que todos los casos se diagnosticaron antes de 1990. Sin embargo:
(i) Todos los expertos del "VIH" están de acuerdo en que la especificidad de los kits de test utilizados entonces era inferior a los utilizados en la actualidad;
(ii) El criterio de WB utilizado para definir "infección" entonces no es suficiente en la actualidad.
Incluso si se acepta los datos de Padian et al del estudio transversal, estimaron que el riesgo de un hombre no infectado de adquirir la infección de "VIH" de su compañera femenina infecatada es de 0,00011 por contacto (1/9000). Esto significa que, en promedio, los hombres que tuviesen relaciones sexuales diarias con una compañera infectada durante 16 años (es decir, 6.000 contactos, a 365 por año), tendrían un 50% de probabilidad de resultar infectados. Si la relación sexual tiene lugar una vez a la semana de promedio, entonces llevaría 115 años alcanzar la misma probabilidad. En tales circunstancias, hay que preguntarse como el "VIH" podía convertirse en epidémico como resultado de una transmisión heterosexual bidireccional.
DT: Pero entonces, ¿cómo puede saberse la diferencia?
LT: Porque nosotros pudimos "pasar" el virus. Pasamos la actividad de RT en nuevos linfocitos, obtuvimos un pico de replicación, seguimos la pista del virus. Es el conjunto de propiedades lo que nos hizo decir que era un retrovirus. Y ¿por qué nuevo?. La primera pregunta que nos hizo Nature fue "¿No es una contaminación de laboratorio? ¿Es quizá un retrovirus de ratón o un retrovirus animal?". A eso se podía decir que no, porque habíamos demostrado que el paciente tenía anticuerpos contra una proteína de su propio virus. ¡El conjunto tiene una lógica perfecta! Pero es importante tomar el conjunto entero. Si se toma cada propiedad separadamente, ninguna es específica, es el conjunto el que da la especificidad.
1. En el estudio de Montagnier et al de 1983, la detección de nada más que actividad de RT en los cultivos estimulados de linfocitos prodecentes de un hombre gay, se consideró como prueba de que estaba infectado con un retrovirus. El hallazgo de la misma actividad en el sobrenadante de un cocultivo de las mismas células con linfocitos de un donante de sangre sano, se consideró como prueba de paso del retrovirus desde los linfocitos del hombre sano a los linfocitos del donante, así como de aislamiento de virus. Sin embargo, el paso de una actividad (RT) no es lo mismo que pasar un objeto (retrovirus).
Además, puesto que linfocitos no infectados con el "VIH" así como muchas bacterias y virus distintos a los retrovirus poseen actividad de RT (la actividad de RT se ha reportado en muchas líneas de células no infectadas con el "VIH" utilizadas para aislar el VIH, como la H9 y la CEM, y tan atrás como en 1972 en linfocitos normales estimulados con PHA), el encontrar RT en cultivos de linfocitos sucesivos, cada uno de los cuales contiene material procedente del anterior, no es prueba ni siquiera de pasar la actividad de RT. Para ilustar lo que Montagnier y sus colegas hicieron, volvamos a la analogía del pescador y su red. Supongamos que el pescador lanza su red y captura algunas criaturas marinas, deja unas pocas en la red como cebo, y entonces la tira de nuevo. En esta ocasión, además de las criaturas marinas también captura algunos peces. Retira los peces, deja algunas criaturas marinas en la red, lanza la red de nuevo, y en esta ocasión atrapa más peces. Repite el procedimiento varias veces y cada vez captura más peces. Al igual que Montagnier et al retiran las células y reutilizan los sobrenadantes, el pescador retira los peces y reutiliza las criaturas marinas (el "cebo"). Es claro que los peces capturados en la red no son descendientes del "cebo". El propósito del "cebo" es crear las condiciones adecuadas para que aparezcan los peces en la red (de hecho, el verdadero pescador pasa toda una vida determinando las condiciones adecuadas). Lo que el pescador está "pasando" son los medios para capturar los peces, no los propios peces. De modo similar, Montagnier et al parecen estar "pasando" las condiciones para generar actividad de RT, creando así la ilusión de "pasar" la actividad de RT.
2. El tener un pico de actividad de RT no es prueba de tener la "replicación" de un retrovirus. El hacer un seguimiento de la RT no es lo mismo que hacer "un seguimiento del virus".
3. Supongamos que se ha aislado y probado la existencia de un retrovirus en cultivos, con tejidos procedentes de seres humanos. "La primera pregunta hecha por Nature" sería "¿es un retrovirus endógeno?" Solamente cuando se tienen pruebas de que no es un retrovirus humano exógeno ni endógeno, surgiría la pregunta de la "contaminación de laboratorio" con retrovirus animales.
4. Lo que el paciente tenía eran anticuerpos que reaccionaban con una proteína, la cual aparecía a 1,16 g/ml en gradientes de densidad de sacarosa. Dado que, a esa densidad, Montagnier y sus colegas no pudieron encontrar partículas con las características morfológicas de un retrovirus, no hay pruebas de que esta proteína fuese retroviral. De hecho no tenían pruebas de que la proteína estuviese ni siquiera incorporada en partículas no retrovirales, cualesquiera partículas presentes a dicha densidad.
5. Si Montagnier y sus colegas sabían de alguna manera de antemano que la proteína que aparecía a 1,16 g/ml y reaccionaba con el suero del hombre gay, era la proteína de un retrovirus que estaba presente en sus linfocitos (y no en los linfocitos del donante sano o del cordón umbilical), y al mismo tiempo que los anticuerpos se dirigían contra "su propio virus", ¿por qué fue necesario hacer todos estos experimentos para demostrar su existencia?
DT: Pero en la densidad de los retrovirus, ¿observó partículas que parecían ser retrovirus, un nuevo retrovirus?
LT: En la densidad de 1,15 ; 1,16 tuvimos un pico de actividad de RT, que es la enzima característica de los retrovirus.
Incluso aunque tuviesen actividad de RT, no tenían pruebas de la existencia de partículas retrovirales a la densidad de 1,16 g/ml, y por tanto dicha actividad no podía considerarse prueba de la existencia de tales partículas.
DT: Pero ¿podría ser otra cosa?
LT: No, en mi opinión era muy claro. No podía ser otra cosa que un retrovirus de ese modo. Porque la enzima que F. Barre-Sinoussi caracterizó bioquímicamente necesitaba magnesio, un poco como el HTLV en otro sitio. Requirió la matriz, la plantilla, y también el cebador, lo que era completamente característico de una RT. No hubo discusión en eso. En Cold Spring Harbour, en septiembre de 1983, Gallo me preguntó si estaba seguro de que era una RT. Yo lo sabía, F. Barre-Sinoussi hizo todos los controles para eso. No era meramente una polimerasa celular, era una RT. Funcionó solamente con cebadores de ARN, e hizo ADN. Eso era seguro.
En 1983, Montagnier, Barre-Sinoussi, Chermann y sus colegas probaron la existencia de la enzima trasncriptasa inversa "usando las condiciones iónicas descritas para el HTLV-I", es decir, "5 mM Mg2+ y poli(A).oligo-(dT)12-18 como cebador-plantilla". Estas condiciones y este cebador-plantilla pueden ser características de los retrovirus, pero no son específicas del RT retroviral, ni de hecho de cualquier RT. Antes incluso de la era del sida se sabía que este cebador-plantilla, bajo las condiciones usadas por Barre-Sinoussi, Montagnier y sus colegas, puede transcribirse no solamente mediante RT, sino también mediante ADN polimerasas. Baste mencionar el estudio titulado: "Characteristics of the RNA dependent DNA polymerase [RT] of a new human T lymphotropic retrovirus (lymphadenopathy associated virus)" ["VIH"], en donde Montagnier, Barre-Sinoussi, Chermann y sus colegas "caracterizaron" la RT del "VIH". Allí utilizarón las mismas condiciones iónicas que en 1983, y tres cebadores-plantillas: "ADN activado", poli (A).oligo-(dT)12-18 y poli Cm .oligo-dG 12-18. Reportaron que mientras que el poli Cm .oligo-dG 12-18, "un cebador-plantilla específico de la transcriptasa inversa" era transcrito solamente por las células "infectadas por VIH", el "ADN activado" y el poli (A).oligo-(dT)12-18 eran transcritos por células infectadas y por no infectadas (22). En otras palabras, el encontrar actividad de RT mediante el cebador-plantilla An.dT12-18, no prueba ni siquiera la existencia de RT, y menos aún la existencia de una RT retroviral.
DT: Con los demás retrovirus que ha conocido en su carrera, ¿siguió el mismo proceso y tuvo las mismas dificultades?
LT: Yo diría que para el VIH fue un proceso fácil. En comparación con los obstáculos que se encuentran para los demás ... porque el virus no emergé, o incluso porque el aislamiento es esporádico, te las arreglas una vez de cada cinco. Estoy hablando de la investigación actual de otras enfermedades. Se puede citar el virus de la esclerosis múltiple del Profesor Perón. Me mostró su trabajo hace una década, y le llevó alrededor de diez años encontrar finalmente una secuencia génica, que está muy cerca de un virus endógeno. Ya ves, es muy difícil, porque no podía "pasar" el virus, no podía hacerlo emerger en el cultivo. Mientras tanto, el VIH emerge muy fácilmente. La cepa LAI, por ejemplo. Eso es por lo que contaminó a las otras.
Sin comentarios.
DT: ¿Con qué cultivó los linfocitos de su paciente? ¿Con la línea de células H9?
LM: No, porque con la H9 no funcionaba en absoluto. Utilizamos muchas líneas de células, y la única que podía producir eran los linfocitos Tambon.
Sin comentarios
DT: Pero utilizando estos tipos de elementos es posible introducir otras cosas capaces de inducir una RT y proteínas, etc.
LM: Totalmente de acuerdo. Eso es por lo que, finalmente, no fuimos muy partidarios de utilizar líneas de células inmortales. Para cultivar el virus en masa sí, pero no para caracterizarlo, porque sabíamos que ibamos a traer otras cosas. Hay líneas de células MT, encontradas por los japoneses (MT2, MT4), que replican el VIH muy bien y que, al mismo tiempo, se transforman mediante el HTLV. Por lo tanto, se tiene una mezcla del VIH y el HTLV, una verdadera sopa.
Estamos de acuerdo con Montagnier en que, cuando se usan cultivos de linfocitos infectados con retrovirus exógenos, como la MT2, la MT4 y la H9 (HUT-78), todos las cuales se originan de pacientes con "leucemia de células T4 adultas", que se dice estar causada por el HTLV-I, es "una verdadera sopa". Sin embargo, dada la existencia de retrovirus endógenos, cuando se utilizan linfocitos de individuos normales y linfocitos de cordón umbilical, el resultado sigue siendo "una verdadera sopa". Quizá una sopa distinta, pero sin embargo todavía "una verdadera sopa".
DT: Más aún, ¿no es posible que los pacientes puedan estar infectados por otros agentes infecciosos?
LM: Podía haber micoplasmas ... podía haber un montón de cosas. Pero afortunadamente tuvimos la experiencia negativa de los virus asociados con cancer, y eso nos ayudó, porque nos habíamos encontrado con todos estos problemas. Por ejemplo, un día tuve un pico muy bueno de RT, que me dio F. Barre-Sinoussi, con una densidad un poco más alta, de 1,19. ¡La comprobé! , era un micoplasma, no un retrovirus.
Estamos de acuerdo en que los pacientes de sida y aquellos en riesgo están infectados con "un montón de cosas". Además, los cultivos con tejidos de estos pacientes, además de estos agentes, podrían también estar infectados in vitro con otros agentes, como el micoplasma.
DT: Con el material purificado en la densidad de los retrovirus, ¿cómo es posible diferenciar entre lo que es viral y no lo es? Puesto que a esta densidad hay muchas otras cosas, incluyendo partículas "con aspecto viral", fragmentos celulares ...
LM: Sí, por eso es más fácil con el cultivo de células, porque se ven las fases de la producción de virus. Se tienen la gemaciones. Charles Dauget (un especialista de ME) vio detalladamente las células. Por supuesto miró el plasma, el concentrado, etc ... no vió nada importante. Porque si se hace un concentrado es necesario hacer una sección fina [para ver un virus con la ME], y para hacer una sección fina es necesario tener un concentrado de al menos el tamaño de la cabeza de un alfiler. De este modo, son necesarias enormes cantidades de virus. Por el contrario, se hace una sección delgada de células muy fácilmente, y en estas secciones delgadas Charles Dauget encontró el retrovirus, con diferentes fases en las gemaciones.
Puede ser cierto que, a veces, es más fácil detectar una partícula con las características morfológicas de los retrovirus en el cultivo que en el plasma. Sin embargo, puesto que el concentrado "viral" se obtiene a partir del sobrenadante del cultivo, y puesto que, por definición, un "concentrado" tendría más partículas por unidad de volumen que el sobrenadante del cultivo, se deduce que debería ser mucho más fácil ver una partícula en el concentrado que en el cultivo. Ya que Montagnier y sus colegas "no vieron nada importante" en el "concentrado", es decir, en la banda de 1,16 g/ml, entonces ¿por qué en su artículo de 1983 dijeron que el "concentrado" no solamente contenía partículas virales, sino virus "purificado"? En la imagen de microscopio electrónico, que Montagnier y sus colegas (incluyendo Charles Dauget) publicaron, hay gemaciones en la superficie de las células, algunas de las cuales son más pronunciadas que otras. Pero ¿cuáles son las pruebas de que son virus o de que están en proceso de convertirse en un virus?
DT: Cuando se miran las fotografías de microscopio electrónico publicadas, para usted, como retrovirólogo, ¿está claro que es un retrovirus, un nuevo retrovirus?
LM: No, en ese momento no se puede decir, Con las primeras imágenes de gemaciones podría ser un virus tipo C. No se puede distinguir.
Estamos de acuerdo en que podría ser cualquier cosa.
DT: ¿Podría ser algo distinto a un retrovirus?
LM: No ... bueno, al final sí, podría ser otro virus en gemación. Pero tenemos un atlas. Se sabe un poco lo que es un retrovirus y lo que no lo es, por familiaridad. Con la morfología es posible distinguirlo, pero conlleva cierta familiaridad.
Estamos de acuerdo en que la familiaridad puede a veces permitir el distinguir entre partículas con aspecto retroviral y otras partículas con aspecto viral, utilizando las características morfológicas. Sin embargo, existen partículas que NO son virus (incluyendo los retrovirus) que presentan características morfológicas idénticas a los retrovirus. Por lo tanto, a partir de consideraciones morfológicas, tanto las partículas en gemación como las libres de células no pueden considerarse como retrovirus. Además, los cultivos de tejidos derivados de pacientes con sida contienen una gran cantidad de partículas con aspecto viral, con diámetros en el rango de 65 a 250 nm, formas que son esféricas, angulares y de lágrima, superficies con y sin salientes, y que contienen núcleos en forma de cono, en forma de barra, centrosimétricos y tubulares, así como núcleos dobles y una mezcla de núcleos. Del mismo modo que con las varias partículas de distinta taxonomía se diferencia la partícula de VIH, ninguna de estas partículas han sido purificadas y caracterizadas, y al igual que el VIH, su origen y función son una incógnita (9, 61-64).
DT: ¿Por qué no hubo purificación?
LM: Repito que no purificamos. Purificamos para caracterizar la densidad de la RT, que era ciertamente la de un retrovirus. Pero no tomamos el pico ... o no funcionó ... porque si se purifica se daña. Así que para partículas infecciosas es mejor no tocarlas demasiado, por lo que simplemente se toma el sobrenadante del cultivo de linfocitos que han producido el virus y se pone en una pequeña cantidad en algunos cultivos nuevos de linfocitos. Y ocurre, se pasa el retrovirus en serie y se obtienen siempre las mismas características, y se aumenta la producción cada vez que se pasa.
1. Si no purificaron las partículas, ¿por qué afirman haberlo hecho y han continuado con la misma afirmación hasta esta entrevista?
2. Es cierto que reportaron el pico de actividad de RT a la densidad de 1,16 g/ml, es decir, a la densidad en donde afirmaron tener "virus purificado, etiquetado". Sin embargo, ¿cómo es posible afirmar que la actividad de RT "era ciertamente la de un retrovirus", cuando "no tomaron el pico ... o no funcionó", es decir, cuando en ese pico no encontraron ni siquiera partículas con aspecto retroviral, mucho menos retrovirus? Para pasar un retrovirus de un cultivo a otro, primero hay que tener pruebas de la existencia del retrovirus en el primer cultivo. El "pasar" fenómenos no específicos no es prueba de pasar un retrovirus. Además, puesto que todos los fenómenos que Montagnier y sus colegas consideraron como prueba de la existencia de un retrovirus, incluyendo la actividad de RT y las partículas de aspecto viral, podrían surgir de novo en los cultivos, especialmente en las condiciones de cultivo que utilizaron, no pueden afirmar haber probado el pasar nada. ¿Cómo Montagnier y sus colegas sabían que, si hubiesen tenido controles adecuados, los mismos fenómenos no hubiesen ocurrido en el cultivo del donante de sangre, así como en los linfocitos umbilicales, incluso si no estuviesen "infectados" con el "VIH"?
DT: Entonces ¿la etapa de purificación no es necesaria?
LM: No, no es necesaria. Lo que es esencial es pasar el virus. El problema que tuvo Peron con el virus de la esclerosis múltiple fue que no pudo pasar el virus de un cultivo a otro. Ese es el problema. Lo logró muy poco, no lo suficiente para caracterizarlo. Y en estos días caracterizar significa por encima de todo a nivel molecular. Si se hace, el procedimiento va más rápidamente. Para hacerlo: un ADN, clonar este ADN, amplificarlo, secuenciarlo, etc. Así se tiene el ADN, la secuencia de ADN que te dice si es verdaderamente un retrovirus. Se sabe la estructura familiar de los retrovirus, todos los retrovirus tienen una estructura genómica familiar con tal y tal gen, que es característica.
1. Si la etapa de purificación (aislamiento) no es necesaria, entonces ¿por qué Montagnier y sus colegas afirman haber probado la existencia del "VIH" porque lo "aislaron", lo "purificaron"?
2. Dado que cualquier pieza de ADN se puede clonar y amplificar, el clonar y amplificar una pieza de ADN no proporciona información ninguna en lo que respecta a su origen, es decir, si es o no es retroviral. Mediante la secuenciación de un fragmento de ADN tampoco es posible decir que es "verdaderamente un retrovirus" , a menos que exista una prueba previa de que estas secuencias están presentes en una partícula retroviral, y en ninguna parte más. No hay nada específico acerca de la "estructura de los retrovirus". Si realmente hay una "secuencia de ADN" singular indicando que "es verdaderamente un retrovirus", y "todos los retrovirus tienen una estructura genómica familiar con tal y tal gen", entonces no existe dicha prueba para el "genoma del VIH" (32). Baste mencionar que, hasta el momento, no se han publicado dos secuencias idénticas del "genoma del VIH". Un mismo paciente puede tener secuencias de "ADN del VIH" distintas. Según investigadores del Instituto Pasteur, "un paciente asintomático puede albergar al menos 106 variantes genéticamente distintas del VIH, y para un paciente de sida la cifra es mayor de 108 (65-66). Las diferencias genéticas pueden alcanzar el 40% (67) (comparar esto con las difefencias del 1-2% entre el ADN de homínidos, algunos de los cuales codifican proteínas idénticas, tales como las cadenas de hemoglobina a y b de chimpancés y humanos). Se ha reportado que la longitud del "ADN del VIH" está entre 9 a 15 Kb. En 1985, los investigadores del Instituto Pasteur reportaron que "La estructura genética deducida es singular; muestra, además de los genes retrovirales gal, pol y env, dos marcos de lectura abierta que llamamos Q y F" (68). En 1990 se dijo que el genoma del "VIH" consistía de diez genes (69), mientras que en 1996, Montagnier reportó que el "VIH" posee ocho genes (70), y según Barre-Sinoussi el "VIH" tiene nueve genes (71).
DT: Entonces, ¿para el aislamiento de retrovirus no es obligatoria la etapa de purificación?, ¿se pueden aislar retrovirus sin purificarlos?
LM: Sí, no es obligatorio transmitir material puro. Sería mejor, pero está el problema de que se daña, y se disminuye la infectividad de los retrovirus.
1. La etapa de purificación ES obligatoria para el aislamiento de los retrovirus. NO SE PUEDE AISLAR retrovirus SIN PURIFICAR. Por definición, aislamiento significa "situar apartado o a solas" (Concise Oxford Dictionary), y purificar significa "limpiar los elementos extraños" (Concise Oxford Dictionary). Por lo tanto, a menos que se quiten los contaminantes del entorno de las partículas de "VIH" (es decir, purificar el "VIH"), las partículas de "VIH" NO ESTÁN AISLADAS.
2. Estamos de acuerdo en que para transmitir un retrovirus no se necesita material puro. Sin embargo, para transmitir algo se tiene que saber primero lo que se está transmitiendo, es decir, hay que tener pruebas de su existencia. Para los retrovirus tal prueba solamente se puede obtener mediante el aislamiento (purificación) de las partículas, determinando sus propiedades físicas y químicas, y demostrando que son infecciosas.
DT: Sin pasar por esta etapa de purificación, ¿no existe riesgo de confusión acerca de las proteínas que se identifican, y también acerca de la RT, que podría provenir de otra cosa?
LM: No, después de todo, repito, si teníamos un pico de RT a la densidad de 1,15; 1,16, hay 999 posibilidades de 1000 de que fuese un retrovirus. Pero podría ser un retrovirus de origen distinto. Repito, hay algunos retrovirus endógenos, pseudo-partículas que pueden ser emitidas por las células, pero aun así, desde la parte del genoma que proporciona retrovirus. Y que se adquiere a través de la herencia, en las células por un tiempo muy largo. Pero finalmente, pensando en la prueba - porque las cosas evolucionan, como la biología molecular, permitiendo incluso una más fácil caracterización hoy en día - es necesario seguir adelante muy rápidamente con la clonación. Y eso se hizo muy rapidamente, tanto por Gallo como por nosotros mismos. La clonación y secuenciación, y así se tenía una caracterización completa. Pero repito, la primera caracterización fue la pertenencia a la familia de lentivirus, la densidad, las gemaciones, etc ... las propiedades biológicas, la asociación con las células T4. Todas estas cosas son parte de la caracterización, y fuimos nosotros quienes las hicimos.
Es imposible determinar la identidad de las proteínas, incluyendo la de la RT, sin aislamiento.
1. Montagnier y sus colegas, incluso después de un esfuerzo romano, ni siquiera pudieron encontrar partículas de aspecto viral a esta densidad. De este modo, de su experiencia (datos experimentales), hay cero posibilidades, no 999 de 1000, de que la actividad de RT a la densidad de 1,15 ; 1,16 , represente un retrovirus en su caso.
2. Estamos de acuerdo en que podría tratarse de un retrovirus de origen distinto. La existencia de los retrovirus endógenos, junto con la presencia en pacientes de sida y aquellos en riesgo de anticuerpos que reaccionan con sus antígenos, significa que incluso si Montagnier et al hubiesen probado la existencia de un retrovirus, habría sido imposible decir que el retrovirus provenía del hombre homosexual y no de los linfocitos de los donantes o del cordón umbilical.
3. La "biología molecular", la "clonación y secuenciación" del genoma del "VIH" se ha analizado en otras partes (32-49). Baste mencionar aquí que:
(a) se afirmó haber probado la existencia del "VIH" y su papel causal en el sida antes de cualquier "biología molecular", "clonación y secuenciación";
(b) puesto que cualquier fragmento de ácido nucléico puede clonarse y secuenciarse, la clonación y secuenciación de un fragmento de ácido nucléico no puede utilizarse para probar la existencia de un retrovirus o de su genoma. Por el contrario, la prueba de la existencia de ácidos nucleicos virales (ARN y ADNc virales) puede aceptarse si y solamente si se demuestra que el ARN es una entidad molecular singular que pertenece a partículas con las características morfológicas, físicas y replicativas de las partículas retrovirales. Esto solamente se puede hacer separando las partículas de todo lo demás, purificándolas. Sin embargo, Montagnier y Gallo utilizaron "una verdadera sopa" de cultivos y cocultivos (el grupo de Montagnier incluso infectó deliberadamente los cultivos con el virus Epstein-Barr). El sobrenadante de estos cultivos fue hecho bandas mediante gradientes de densidad de sacarosa. De todo el ARN (y ADN) que se concentró a 1,16 g/ml, eligieron arbitrariamente algunos ARN, utilizando criterios específicos totalmente no retrovirales, y lo llamaron "ARN del VIH", sin ninguna prueba de que la banda contuviese ni siquiera partículas con aspecto retroviral (32);
(c) el primer paso, absolutamente necesario para demostrar que el "ARN del VIH", retroviral o no, provenía de los linfocitos de los individuos infectados con el "VIH", es realizar experimentos de hibridación utilizando linfocitos frescos, sin cultivar, y el "ADN del VIH" (obtenido mediante transcripción inversa del "ARN del VIH") como una sonda. Es difícil de entender por qué Montagnier y sus colegas no reportaron tales experimentos. El grupo de Gallo sí lo hizo, y los resultados fueron negativos. En 1994 Gallo fue citado en esta revista diciendo: "Nunca hemos encontrado ADN del VIH en las células tumorales de KS ... En realidad nunca hemos encontrado ADN del VIH en células T" (72). En la actualidad no existe ningún estudio que pruebe la existencia de ninguna copia del "genoma del VIH de longitud completa" en las células T frescas de ningún paciente de sida o paciente en riesgo de sida;
(d) En la actualidad, el número de partículas de "VIH" en plasma se cuantifica midiendo el "ARN del VIH", la carga viral, que se informó que es "de 15 x 103 a 554 x 103 viriones por ml" (73). Muchos estudios afirman probar que la "carga viral", el "ARN del VIH", se puede disminuir a niveles indetectables mediante el uso de inhibidores de RT y de proteasa. Sin embargo, ya que:
(i) se acepta que el "ARN del VIH" es una transcripción del "ADN del VIH";
(ii) por su naturaleza, ni los inhibidores de RT ni de la proteasa tienen ningún efecto en la transcripción de ADN, solamente inhiben la infección de nuevas células, es decir, la disminución en el "ARN del VIH" es una consecuencia de la disminución del "ADN del VIH";
sería de esperar que el efecto de estos fármacos se determine midiendo el nivel de "ADN del VIH". Sin embargo, apenas se han publicado tales estudios. Los muy pocos que existen muestran que ni los inhibidores de RT ni los de proteasa tienen ningún efecto en el "ADN del VIH" (74-76), lo que significa que no hay relación entre el "ARN del VIH" y el "ADN del VIH".
4. En 1984, Montagnier y sus colegas informaron que "la preincubación de los linfocitos T4+ con tres anticuerpos monoclonales distintos dirigidos a la glicoproteína T4 bloqueó la infección de células mediante LAV", es decir, bloqueó la detección de actividad de RT en células T4 "infectadas" con el "VIH". Concluyeron que sus "hallazgos sugieren fuertemente que la glicoproteína T4 al menos se asocia con todo o parte del receptor de LAV" (38). Sin embargo, el bloqueo de un fenómeno de "VIH" no específico, concretamente la actividad de RT, no puede considerarse como prueba de bloquear la infección por "VIH" o la asociación del "VIH" con las células T4.
DT: Pero llega un momento en que se debe hacer la caracterización del virus, es decir, ¿de qué proteínas está compuesto?
LM: Así es, porque el análisis de las proteínas del virus exige la producción en masa y la purificación, es necesario hacerlo. Y ahí debería decir que eso falló parcialmente. J.C. Chermann estaba a cargo de eso, al menos para las proteínas internas, y tuvo dificultades para producir el virus y no funcionó. Pero esto era una forma posible, la otra forma era tener el ácido nucléico, la clonación, etc. En esta manera funcionó muy rapidamente. El otro modo no funcionó porque tuvimos en ese momento un sistema de producción que no era lo suficientemente robusto. No se produjeron suficientes partículas para purificar y caracterizar las proteínas virales, no se pudo hacer. No se pudo producir una gran cantidad de virus en ese momento porque este virus no emergió en la línea celular inmortal. Lo pudimos haber hecho con el virus LAI, pero en ese momento no sabíamos eso.
Estamos de acuerdo en que "el análisis de las proteínas del virus exige la producción en masa y la purificación, es necesario hacer eso". A este respecto, no fracasaron solamente en parte, sino que FRACASARON TOTALMENTE. Si el "análisis de las proteínas del virus exige la producción en masa y la purificación", también lo exige el análisis de "acidos nucléicos, clonación, etc". Si se falla en purificar el virus, entonces también:
(a) se falla en caracterizar los antígenos virales y en obtener un estándar oro para la reacción antígeno-anticuerpo, es decir, no se puede utilizar los tests de anticuerpos para definir la infección con el retrovirus;
(b) se falla en obtener y caracterizar los ácidos nucléicos retrovirales, el ARN (ADNc), y de este modo las sondas e cebadores para estudios de hibridación y de PCR. Es decir, no se pueden utilizar tests moleculares para definir la infección retroviral. Que esto es así es aceptado por Donald Francis, un investigador que, junto a Gallo, jugó un papel importante en el desarrollo de la teoría de que el sida está causado por un retrovirus. En 1983, Francis, entonces colaborador jefe de las Actividades de Laboratorio del Sida, Centers for Disease Control de los Estados Unidos, y ex jefe del programa de la viruela de la OMS, especuló sobre una causa viral del sida: "Hay que confiar en métodos de detección más elaborados, mediante los cuales, con alguna herramienta específica, se pueda "ver" el virus. Algunas sustancias específicas, como los anticuerpos o los ácidos nucléicos, identificarán los virus, incluso si las células continúan vivas. El problema aquí es que tales métodos solamente se pueden desarrollar si sabemos lo que estamos buscando. Es decir, si estamos buscando un virus conocido podemos vacunar a una cobaya, por ejemplo, con virus puro ... Obviamente, sin embargo, si no sabemos qué virus estamos buscando, y somos por tanto incapaces de producir anticuerpos en cobayas, es difícil usar estos métodos ... estaríamos buscando algo que podría estar o podría no estar allí, utilizando técnicas que podrían funcionar o no funcionar" (77) (cursiva nuestra).
DT: ¿Gallo lo hizo?
LM: ¿Gallo? ... No sé si realmente purificó, no lo creo. Creo que él se puso de lleno muy rápidamente con la parte molecular, es decir la clonación. Lo que él hizo es el Western blot. Nosotros utilizamos la técnica RIPA, y lo que lo que ellos hicieron que era nuevo fue que mostraron algunas proteínas que no se habían visto bien con la otra técnica. Aquí se tiene otro aspecto de caracterizar el virus. No se puede purificar, pero si se sabe que alguien tiene anticuerpos contra las proteínas del virus, se puede purificar el complejo anticuerpo-antígeno. Eso es lo que se hizo. Y así se tenía una banda visible, marcada radioactivamente, que se llamó proteína 25, p25. Y Gallo vio otras. Se tuvo la p25, que él llamó p24, se tuvo la p41, que nosotros vimos ...
Es imposible caracterizar dos incógnitas virales, concretamente sus proteínas y los anticuerpos dirigidos contra ellas, por la formación de un complejo anticuerpo-antígeno, mucho menos caracterizar el "virus". ¿Por qué medios Montagnier sabía que alguien tenía anticuerpos contra las proteínas del virus, y que las proteinas con las que los anticuerpos reaccionan eran virales? Es imposible científicamente saber que alguien tiene anticuerpos a un virus y, al mismo tiempo, que la banda de 1,16 g/ml contiene proteínas del mismo virus antes de que se haya probado su existencia.
DT: Sobre los anticuerpos, numerosos estudios han demostrado que estos anticuerpos reaccionan con otras proteínas o elementos que no forman parte del VIH. Y que no pueden ser suficientes para caracterizar las proteínas del VIH.
LM: ¡No!, porque teníamos controles. Teníamos personas que no tenían sida y no tenían anticuerpos contra estas proteínas. Y las técnicas que utilizamos las había refinado yo mismo algunos años antes, para detectar el gen src. Se puede ver que el gen src se detectaba por inmunoprecipitación también. Fue la p60 [proteína p60]. Yo fui muy hábil, y mi técnico también, con la técnica RIPA. Si se tiene una reacción específica, es específica.
1. Es cierto que Montagnier hizo controles, pero no fueron adecuados. Montagnier y sus colegas hicieron reaccionar las proteínas que se concentraron a 1,16 g/ml con los sueros de dos pacientes homosexuales con linfadenopatía. Ya se sabía que los pacientes con sida y aquellos en riesgo tenían una gran cantidad de anticuerpos, todos con reactividad cruzada potencial. Por lo tanto, se hubiese esperado que Montagnier et al hubiesen utilizado como control individuos enfermos que no tuviesen sida o pre-sida, y que no estuviesen en riesgo de sida, pero que también tuviesen una gran cantidad de anticuerpos, todos con reactividad cruzada potencial. Sin embargo, sus controles consistieron en dos donantes de sangre, cuyo estado de buena salud se caracteriza por niveles bajos de anticuerpos.
2. Montagnier et al no tuvo pruebas de una "reacción específica". Los sueros de los pacientes y los donantes se hicieron reaccionar con el "virus purificado", es decir, la banda de 1,16 g/ml, y con extractos de las células "infectadas". En sus tiras publicadas, con "virus purificado", no es posible distinguir ninguna proteína que reacciona con ninguna de los sueros. En el texto afirman: "Cuando se analizó el virus purificado, etiquetado [la banda de 1,16 g/ml] del paciente 1, se pudieron ver tres proteínas principales: la proteína p25 y proteínas con peso molecular de 80.000 y 45.000". No se reportaron tales reacciones con los sueros de los donantes. En las tiras publicadas con extractos de las "células infectadas", es obvio que muchas proteínas reaccionaron con el suero de los pacientes y el suero de los donantes de sangre sanos. Un año después, Montagnier y sus colegas confirmaron que "los sueros de algunos pacientes de sida se vincularon a muchas proteínas celulares ... Estas bandas fueron claras en el RIPA, y solamente se consideraron como positivos los sueros que precipitaron específicamente la p25". En otras palabras, por alguna razón desconocida, concluyeron que de todas las proteínas que reaccionaban solamente la p24 (su p25) era retroviral, y de todos los anticuerpos solamente el que reaccionaba con la p24 estaba dirigido contra el retrovirus. Incluso si se considera específica la reacción entre la p24 que se obtiene de la banda de 1,16 g/ml y el anticuerpo presente en los sueros, es decir, no se debe a una reactividad cruzada, de tal reacción es imposible sacar la conclusión de que la p24 es una proteína retroviral, y que el anticuerpo es provocado como resultado de la infección con este retrovirus. Ciertamente, dado el hecho de que Montagnier et al no pudieron ni siquiera detectar partículas de aspecto retroviral a 1,16 g/ml, sus conclusiones con respecto a la p24 y el anticuerpo que reacciona con ella desafía por completo el razonamiento científico.
DT: Pero se sabe que los pacientes de sida están infectados con multitud de otros agentes infecciosos que son susceptibles a ...
LM: Ah, sí, pero los anticuerpos son muy específicos. Saben como distinguir una molécula de un millón, hay una afinidad muy grande. Cuando los anticuerpos tienen suficiente afinidad, se obtiene algo realmente muy específico. Con los anticuerpos monoclonales se obtiene realmente una proteína. Todo eso se utiliza para la detección de antígenos de diagnóstico.
1. No hay anticuerpos, ni siquiera los anticuerpos monoclonales, que sean "muy específicos", ni siquiera específicos (78-84). De hecho, hay casos en los que "el antígeno de reacción cruzada se une con mayor afinidad que el propio antígeno homólogo .. El hecho más evidente acerca de las reacciones cruzadas de los anticuerpos monoclonales, es que son característicos de todas las moléculas, y no pueden eliminarse por absorción sin eliminar toda la reactividad ... Incluso antígenos que difieren en la mayoría de su estructura pueden compartir un determinante, y un anticuerpo monoclonal que reconozca este sitio daría entonces una reacción cruzada al 100%. Un ejemplo es la reacción de autoanticuerpos en el lupus, con tanto ADN como cardiolopina" (80).
Sin embargo, "debe enfatizarse en que compartir un 'determinante' no significa que los antígenos contengan estructuras químicas idénticas, sino más bien que tienen un parecido químico que podría no ser bien comprendido, por ejemplo, una distribución de cargas superficiales" (80). Es importante observar que los expertos del "VIH" reconocen a la "reactividad cruzada" como el motivo de la reactividad de anticuerpos "indeterminada" vista en el Western blot del "VIH", así como, por ejemplo, la reactividad entre los anticuerpos monoclonales a la proteína p18 del "VIH" y las células dendríticas en los tejidos linfáticos de una variedad de pacientes con un número de enfermedades no relacionadas con el sida (85), y tejidos normales tomados de personas no infectadas con el "VIH" (86). Para convencerse de que todos "los anticuerpos [incluyendo monoclonales] son poliespecíficos, es decir, son capaces de reaccionar con varios antígenos distintos tales como: proteínas, ácidos nucléicos y haptenos", "son capaces de reaccionar con más que con antígenos propios o no propios, con frecuencia sin similitudes antigénicas aparentes", todo lo que hay que hacer es leer las publicaciones científicas de los investigadores del Instituto Pasteur, como las de Straits Avrameas (83-87).
2. No se puede concluir que una proteína que se concentra a 1,16 g/ml es viral meramente porque reaccione con un anticuerpo presente en los sueros de los pacientes, incluso si de alguna manera se supiese que los anticuerpos presentes en los sueros son monoclonales. Supongamos una situación ideal donde:
(a) todos los anticuerpos presentes en los sueros de los pacientes son monoclonales y "muy específicos";
(b) la banda de 1,16 g/ml contiene, además del mucho material incorpóreo y microvesículas, proteínas corpóreas de origen celular, y tal vez de origen bacteriano, fúngico y viral (constituyentes de los muchos agentes infecciosos, distintos a los retrovirus, presentes en el cultivo y los pacientes), y, como se mostró en el estudio franco-alemán de 1997, un número de partículas con aspecto retroviral.
Incluso en esta situación ideal, NO ES POSIBLE AFIRMAR que solamente porque una proteína, como la p24, la p41 u otras, se encuentra en esta banda y reacciona con los sueros, la proteína es un componente de las partículas con aspecto retroviral.
3. La realidad es que:
(a) todos los pacientes de sida y aquellos en riesgo tienen una gran cantidad de anticuerpos, incluyendo autoanticuerpos. Los autoanticuerpos incluyen antilinfocitos, y como Montagnier y sus colegas han mostrado, anticuerpos antiactina y antimiosina, es decir, anticuerpos a las dos proteínas celulares ubicuas actina y miosiona;
(b) todos los anticuerpos presentes en los sueros tienen el potencial de reaccionar cruzadamente;
(c) las proteínas del sobrenadante de linfocitos no infectados, que en gradientes de densidad de sacarosa se concentran a 1,16 g/ml, el virus simulado, incluye proteínas que tienen los mismos pesos moleculares que las proteínas del "VIH" (89);
(d) los animales inoculados con el virus simulado desarrollan anticuerpos que reaccionan con las proteínas del "SIV", un "retrovirus" cuyas proteínas comparten los mismos pesos moleculares que las proteínas del "VIH", y que se dice que es el pariente más cercano del "VIH" (90);
(e) los pacientes de sida y aquellos en riesgo están sometidos repetidamente a estímulos alogénicos, incluyendo linfocitos alogénicos;
(f) hasta 1997 no se tuvieron datos que mostrasen que la banda de 1,16 g/ml contuviese ni siquiera partículas de aspecto retroviral.
Ante esta realidad, afirmar que solamente porque una proteína se concentra a 1,16 g/ml y reacciona con los anticuerpos presentes en los sueros de los pacientes es, en el caso mejor, algo no distinto que lo siguiente:
(i) Un investigador tiene dos recipientes, uno de ellos contiene una mezcla de huevos crudos, algunos conocidos y tal vez algunos desconocidos, y tal vez un poco de leche procedente de varios animales. El otro contiene varios ácidos, de nuevo algunos conocidos y tal vez algunos desconocidos. Una vez que los contenidos de los dos recipientes se mezclan, el investigador obtiene un precipitado. Afirma que la precipitación prueba la existencia en el recipiente de leche de un animal previamente desconocido, y de un ácido desconocido, y que la reacción es entre el ácido desconocido y una proteína de la leche previamente desconocida.
(ii) Esta afirmación es científicamente imposible, ya que cualquier proteína en los huevos podría haber reaccionado con cualquier ácido para producir el precipitado observado.
De este modo, dada la realidad tal y como se indica en (a) a (f), es totalmente acientífico afirmar que la reacción entre proteínas que se concentran a 1,16 g/ml y anticuerpos presentes en los sueros de los pacientes prueba la existencia del "VIH". Afirmar que la reacción entre proteínas que se concentran a 1,16 g/ml (en ausencia de pruebas de que la banda contenga ni siquiera partículas de aspecto retroviral) con anticuerpos presentes en los sueros indica, no solamente que la banda contiene proteínas retrovirales, sino las proteínas de un nuevo retrovirus, no es distinto de lo siguiente: Un pescador que tiene criaturas marinas pero no peces en una red, lanza algunos animales en la red. El pescador observa que los animales comen algunas proteínas presentes en la red, y asegura que las proteínas eran no solamente proteínas de peces, sino las proteínas de un pez completamente nuevo, un pez que nadie ha visto antes, un pez dorado.
DT: Para usted la p41 no tenía origen viral, por lo que no pertenecía al VIH. Para Gallo era la proteína más específica del VIH. ¿Por qué esta contradicción?
LM: Los dos teníamos bastante razón. Quiero decir que yo, en mi técnica RIPA ... en efecto hay proteínas celulares que se encuentran en todas partes. Hay un "ruido de fondo" no específico, y entre estas proteínas hay una muy abundante en las células, que es la actina. Y esta proteína tiene un peso molecular de 43.000 kd. Así que allí estaba, y yo tenía bastante razón, pero lo que Gallo vio por otra parte fue la gp41 del VIH, porque él estaba utilizando el Western Blot. Y yo lo he reconocido.
1. No es posible que tanto Montagnier como Gallo tuviesen "bastante razón". Tanto Gallo como Montagnier hicieron reaccionar la banda de 1,16 g/ml con sueros de pacientes. Independientemente del método utilizado para detectar la reacción (RIPA o WB), o del número de reacciones realizadas, deberían haber encontrado las mismas proteínas reactivas.
2. En su estudio de 1983, Montagnier y sus colegas encontraron tres proteínas: la p25, la p45 y la p80. Respecto a la p45 escribieron: "La proteína de 45K podría deberse a contaminación del virus con actina celular, que estaba presente en los inmunoprecipitados de todos los extractos de células" En un estudio publicado en 1984 tuvieron "una p25 prominente, una p18, una proteína de bajo peso molecular en la parte inferior del gel (p12), y tres proteínas de alto peso molecular (43.000, 53.000, 68.000). La banda de 43.000 podría incluir un componente de origen celular, ya que también se encontró en una preparación similar realizada con las células no infectadas de control".
3. Puesto que los sueros de los pacientes y de los donantes de sangre sanos reaccionaron repetidamente con la proteína p45/p43 de células infectadas y no infectadas, habría sido de esperar que Gallo también detectase esta proteína. Sin embargo, ni Gallo ni nadie más desde entonces reportaron tal banda, independientemente del método utilizado para detectar la reacción antígeno-anticuerpo. La discrepancia se puede resolver si se toma en consideración el hecho de que la migración de las proteínas en una tira electroforética, además del peso molecular, puede también estar influenciada por otros factores, por ejemplo la carga que lleva la proteína. De este modo, una misma proteína puede parecer tener un peso molecular ligeramente distinto cuando se detecta mediante RIPA o mediante WB. Por ejemplo, la p25 detectada por Montagnier y la p24 detectada por Gallo se consideran en la actualidad que son la misma proteína p24 del "VIH".
4. El peso molecular de la actina no es 45.000 ni 43.000, sino 41.000. En la actualidad existen muchas pruebas de que la banda de 1,16 g/ml, el "VIH puro", contiene actina celular (91-94), y como ya se ha mencionado, el propio Montagnier mostró que los sueros de los pacientes de sida y aquellos en riesgo contienen anticuerpos que reaccionan con la actina. En otras palabras, cuando se hace reaccionar la banda de 1,16 g/ml con los sueros de los pacientes, independientemente de la presencia del "VIH", debe estar presente una banda p41 (p45/43), y representa actina celular (si Montagnier ahora cree que la p41 es una proteína del "VIH", ¿por qué persiste en excluir esta banda de sus criterios de un Western blot positivo? (95)).
DT: Para usted la p24 fue la proteína más específica del VIH, para Gallo en absoluto. Se sabe, gracias a otros estudios, que los anticuerpos dirigidos contra la p24 se encontraron a menudo en pacientes que no estaban infectados con el VIH, e incluso en ciertos animales. De hecho, hoy en día, una reacción de anticuerpo con la p24 se considera no específica.
LM: No es suficiente para el diagnóstico de la infección por VIH.
La proteína p24 no es suficiente para el diagnóstico de la infección por "VIH" porque no es específica. De hecho, no se ha reportado que ninguna otra proteína del "VIH", ni siquiera la p41 (p45/43), reaccione con más frecuencia con los sueros de personas sanas (sin riesgo de sida). Tampoco se ha encontrado que ningún anticuerpo monoclonal a cualquiera de las otras proteínas del "VIH" reaccione con más frecuencia con las proteínas presentes en cultivos o sueros no "infectados" de personas sin riesgo de sida. Según Montagnier, puesto que:
(a) "hay proteínas celulares que se encuentran en todas partes, hay un ruido de fondo no específico";
(b) una de esas proteínas, la que tiene un peso molecular de 45/43, es actina;
(c) esta proteína reaccionó con los sueros de individuos sin riesgo de sida;
la p45/43 representa una proteína celular, y no viral. Sin embargo, puesto que:
(i) la miosina es tan ubicua como la actina;
(ii) la miosina tiene una cadena ligera con un peso molecular de 24.000;
(iii) se han reportado las proteínas del citoesqueleto (de las que la actina y la miosina son las más abundantes) en el "VIH puro" (91-94). De hecho, se dice que la miosina y la actina son cruciales en la gemación y la liberación de partículas de "VIH" (91);
(iv) Montagnier ha mostrado que los pacientes con sida y en riesgo de sida tienen anticuerpos antimiosina.
¿Por qué no debería considerarse la banda p24 como representante de la miosina?
DT: ¿No es suficiente una proteína?
LM: No es suficiente una proteína de ninguna manera. Pero en ese momento el problema no se mostró así. El problema era saber si era un HTLV o no. El único retrovirus humano conocido era el HTLV, y nosotros demostramos claramente que no era un HTLV, que los anticuerpos monoclonales de Gallo contra la p24 del HTLV no reconocían la p25 del VIH.
Estamos de acuerdo en que una proteína no es suficiente para diagnosticar la infección por "VIH". El problema entonces, como es ahora, no era "saber si era un HTLV o no", sino si era retroviral o no. No todo lo que no es HTLV es retroviral.
DT: En la densidad de los retrovirus, 1,16 g/ml, hay muchas partículas, pero solamente el 20% tienen que ver con el VIH. ¿Por qué el 80% de las proteínas no son virales y las otras sí lo son? ¿Cómo se pueden distinguir?
LM: Hay dos explicaciones. Por una parte, a esta densidad se tiene lo que se llaman microvesículas de origen celular, que tienen aproximadamente el mismo tamaño que el virus. Y también el propio virus, en gemación, aporta proteínas celulares. Así que efectivamente estas proteínas no son virales, son de origen celular. Entonces, ¿como distinguirlas de las virales?. Francamente con esta técnica no se puede hacer con precisión. Lo que podemos hacer es purificar el virus al máximo con gradientes sucesivos, y siempre se tropieza con las mismas proteínas.
1. Hasta la fecha no hay ninguna prueba de que ninguna de las proteínas que se concentra a 1,16 g/ml sean proteínas del "VIH". La única razón por la que se dice que el 20% de las proteínas que se concentran a 1,16 g/ml son "VIH", es que esta fracción de proteínas reacciona con distintos sueros de pacientes de sida en algún momento u otro.
2. Estamos de acuerdo que con la técnica utilizada por el grupo de Montagnier, no se puede probar qué proteínas (o ácidos nucléicos) son celulares o virales.
3. Estamos de acuerdo en que el único modo de probar la existencia de una proteína viral (ácidos nucléicos) es "purificar el virus al máximo", es decir, obtener gradientes de densidad que contienen solamente partículas con las características morfológicas de los retrovirus, y nada más. Esto nunca se ha realizado para probar la existencia de las proteínas y ácidos nucléicos del "VIH".
4. Si siempre "se tropieza con las mismas proteínas" en gradientes sucesivos, eso no prueba que estas proteínas sean virales y que las que desaparecen sean celulares.
DT: ¿Las otras desaparecen?
LM: Digamos que las otras se reducen un poco. Se van las microvesículas, pero cada vez se pierde mucho virus, por lo que es necesario tener mucho virus al comienzo con el fin de que se mantenga un poco al llegar al final. Y de nuevo, es el análisis molecular, es la secuencia de estas proteínas lo que va a permitir decir si son o no son de origen viral. Eso es lo que comenzamos para la p25, que falló ... y la otra técnica es hacer la clonación, y así entonces se tiene el ADN, y del ADN se obtienen las proteínas. Se deducen la secuencia de las proteínas y su tamaño, y se tropieza de nuevo en lo que ha se ha observado con inmunoprecipitación o con electroforesis en gel. Y se sabe por analogía con los tamaños de las proteínas de otros retrovirus, se pueden deducir bastante bien estas proteínas. Por tanto se tiene la p25, que estaba cerca de la p24 del HTLV, se tiene la p18 ... al final tienes las otras. Por otra parte, la que fue muy diferente fue la proteína muy grande p120.
1. No importa cuantas veces se repita la concentración en bandas, si se parte de no tener partículas con aspecto retroviral, se terminará sin esas partículas. Algunas veces, mediante sucesivas concentraciones en bandas, se podría eliminar los componentes no retrovirales y obtener una banda que contiene solamente partículas con las características morfológicas de los retrovirus. Sin embargo, para poder hacer eso, incluso después de la primera concentración en bandas, se debe comenzar con una proporción relativamente alta de partículas de aspecto retroviral.
2. Una vez más, el origen de las proteínas no se puede determinar con análisis molecular, es decir, mediante la secuenciación de las proteínas.
3. Estamos de acuerdo en que si las proteínas de un retrovirus están codificadas por su genoma, como se acepta generalmente, entonces podría se posible caracterizar las proteínas retrovirales mediante su genoma. Sin embargo, para hacer esto primero debe probarse que el ARN (ADNc) es un componente de una partícula retroviral. Esto no se ha hecho para el genoma del "VIH". De hecho, incluso hoy en día no hay ninguna prueba de que el ARN del "VIH" sea el componente de una partícula, cualquier partícula viral o no viral.
4. Hasta la fecha no hay pruebas de una relación entre las secuencias del ARN (ADN) del "VIH" y las secuencias de las proteínas "observadas con inmunoprecipitación o con electroforesis en gel". De hecho, ni siquiera hay relación entre el tamaño de las proteínas codificadas por los genes del "VIH" y el tamaño de las proteínas "observadas con inmunoprecipitación o con electroforesis en gel". Por ejemplo, en 1987 Gallo y sus colegas realizaron un "análisis asistido por ordenador" de las "secuencias de aminoácidos de los complejos de proteína de envoltura derivadas de las secuencias de ácido nucléico de siete aislamientos del virus del sida", y concluyeron que "la gp41 debería ser de 52 a 54 daltons por cálculo" (96).
5. Uno de los muchos aspectos desconcertantes del "VIH" es el siguiente:
(a) los expertos del "VIH" están de acuerdo en que no hay dos "VIH's" que tengan la misma secuencia genómica, pudiendo ser la diferencia tan alta como 40% (67)
(b) también admiten que la inmensa mayoría (99,9%) de los genomas del "VIH" son defectuosos, es decir, parte de un gen(es) o el total del gen(es) no están. ¿Como es posible entonces:
(i) medir la carga viral ("ADN del VIH" y "ARN del VIH") mediante el uso de las mismas sondas de hibridación e cebadores de PCR?
(ii) realizar pruebas de anticuerpos mediante el uso de kits que contienen los mismos antígenos para todos los distintos "VIH's"?
Ciertamente, la historia de cómo los investigadores del "VIH" han tratado de probar la existencia de la p120 y la forma en que, en última instancia, estuvieron de acuerdo en su existencia, es muy interesante e ilustrativa (32). Sin embargo, aunque se dice que la proteína p120 está presente solamente en los botones, hasta ahora no se han reportado partículas de "VIH" libres de células que tengan botones. Se deduce que ni las partículas en el sobrenadante del cultivo ni el virus "puro" tendrán la gp120. En otras palabras, es imposible que las tiras de RIPA o de WB tengan una proteína del "VIH" con un peso molecular de 120.000.
DT: En la actualidad, ¿los problemas acerca de la producción masiva del virus, la purificación, las fotos de ME a 1,16, están resueltos?
LM: Sí, por supuesto.
No se encuentra tal prueba en la literatura publicada.
DT: ¿Existen fotos de ME del VIH de la purificación?
LM: Sí, por supuesto.
1. Antes de marzo de 1997, ningún grupo de investigadores del "VIH" había publicado ni una sola micrografía electrónica de material concentrado a la densidad de 1,16 g/ml mediante gradiente de densidad de sacarosa. Las primeras ME's de material concentrado mediante gradientes de densidad de sacarosa aparecieron en 1997 en dos publicaciones, una franco-alemana y la otra del US National Cancer Institute (NCI) (89). Las ME's franco-alemanas son del gradiente de densidad de sacarosa a 1,16 g/ml, mientras que no es posible saber de qué densidad provienen los datos del NCI. Los datos de ambos estudios revelan que la gran mayoría del material es "no viral", virus "simulado", "microvesículas" celulares, es decir, el material concentrado es prácticamente todo celular. Estas partículas, como las partículas retrovirales, contiene ácidos nucléicos además de proteínas, pero no están tan condensados.
2. Las ME de ambos estudios también contienen una pequeña cantidad de partículas que tienen morfologías más parecidas a la de partículas retrovirales que las partículas "simuladas". Ambos grupos afirman que esas pocas partículas son "VIH".
3. En el estudio del NCI no se dan razones para afirmar que esas partículas son "VIH". Los autores del estudio franco-alemán afirman que las partículas son "VIH" porque tienen:
(a) "diámetros de unos 110 nm";
(b) "núcleo en forma de cono denso";
(c) "cuerpos laterales"
y porque no se vieron tales partículas en el material concentrado procedente de las células de control no "infectadas". Sin embargo, según investigadores retrovirales bien conocidos, como Bader y Frank, un tipo de "partícula oncoviral" puede cambiar a otro, y los núcleos inmaduros "madurar", simplemente cambiando las condiciones extracelulares (11-97). Sin embargo, las condiciones del cultivo en las células "infectadas" y no infectadas no fueron las mismas. Dos características morfológicas comunes a todos los retrovirus son tener un diámetro de 100-120 nm y los botones de superficie. Ninguna de las partículas parece tener botones y ninguna tiene un diámetro de menos de 120 nm. Promediando el mayor y el menor diámetro de las partículas que se dice que representan al "VIH", y asumiendo que todas las partículas son esféricas, se obtiene que en el estudio franco-aleman las partículas son 1,14 veces más grandes que las partículas retrovirales ortodoxas, y las partículas del NCI son 1,96 veces más grandes. Estos datos se traducen en volúmenes 50% y 750% mayores, respectivamente. Puesto que la densidad es la relación de la masa al volumen, estas partículas deben por tanto tener unas masas mayores. Teniendo en cuenta el diámetro máximo de las partículas retrovirales, y el hecho de que dichas partículas contienen una masa fija de ARN y proteínas, parece insostenible que las partículas que ambos grupos consideran como el "VIH" sean la misma partícula o sean partículas retrovirales. La única explicación de estos datos es que las micrografías electrónicas no son de la banda de 1,16 g/ml, o que las concentraciones no han sido hasta el equilibrio, en cuyo caso habría que redefinir la densidad de flotación de los retrovirus.
Se dice que las partículas de "VIH" tienen un núcleo viral con forma de cono, con cuerpos laterales densos a cada lado del cono. No se puede ver tal característica en la ME publicada en estos dos estudios. Por tanto, por definición, ni siquiera puede decirse que las partículas son de aspecto retroviral.
Teniendo en cuenta que en ambos estudios los cultivos "no infectados" de control fueron de células H9, y el hecho de que Gallo ya en 1983 afirmó que estas células están infectadas con HTLV-I, el no reportar partículas de aspecto viral en el material de banda a partir de estos cultivos es un enigma.
DT: ¿Han sido publicadas?
LM: No podría decirte ... tenemos algunas en alguna parte ... pero no tienen interés, ningún interés.
Las fotos de 1,16 g/ml son de un profundo interés. ¿Cómo si no se puede saber que hay partículas de aspecto retroviral allí, especialmente ya que incluso Montagnier admite que otras cosas pueden concentrarse allí? Para cualquier científico, que afirme haber probado la purificación de un retrovirus utilizando concentración de gradiente de densidad de sacarosa, es fundamental y absolutamente necesario obtener micrografías electrónicas de la banda de 1,16 g/ml, mostrando nada más que partículas de aspecto retroviral.
DT: Hoy en día, con la producción en masa del virus, ¿es posible ver una ME, tras la purificación, de un gran número de virus?
LM: Sí, sí, claro que sí. Pueden verse, incluso se ven bandas visibles.
Si ese es el caso, ¿por qué tales datos no están disponibles en la literatura científica?
DT: Entonces, ¿para usted el VIH existe? LM: Oh, está claro, yo lo ví y lo encontré.
En uno de sus artículos de 1984, Montagnier y sus colegas escribieron: "Varias características indican que el LAV o los virus relacionados con LAV pertenecen a la familia de los retrovirus. Se han observado mediante microscopio electrónico partículas en gemación en la membrana plasmática. La densidad del virus en gradiente de sacarosa es 1,16 , y se ha encontrado que la actividad de transcriptasa inversa dependiente de Mg2+ está asociada con viriones que contienen ARN". Sin embargo, es esta entrevista Montagnier admite:
(a) "Publicamos imágenes de partículas en gemación que son características de los retrovirus. Dicho esto, decir que de solamente la morfología no se podía afirmar que era realmente un retrovirus ... Con las primeras imágenes de gemaciones podría ser un virus tipo C. No se puede distinguir ... No ... bueno, al final sí, podría ser otro virus en gemación".
(b) en la densidad de sacarosa de 1,16 g/ml no solamente Montagnier y sus colegas no vieron ninguna partícula retroviral, dijeron repetidamente que no vieron partículas con aspecto retroviral;
(c) aunque en la densidad de sacarosa de 1,16 g/ml detectaron transcripción inversa del cebador plantilla An.dT12-18 en presencia de Mg2+, no tuvieron partículas, y por tanto no tuvieron pruebas de "actividad de transcriptasa inversa asociada con viriones que contienen ARN".
Además, en este estudio (22), mostraron que las ADN polimerasas beta y gama, y de células no infectadas, transcriben An.dT(12-18) en presencia de Mg2+. Por tanto, las propias condiciones y datos de Montagnier no prueban su afirmación de que lo que "vio" y "encontró" es un retrovirus. Si el "VIH" existe, y está "claro" para Montagnier que él "lo vio" y "lo encontró", ¿dónde están sus pruebas?
Eleni Papadopulos-Eleopulos (1) Valendar F.Turner (2) John M. Papadimitriou (3) Barry Page (1) & David Causer (1)
(1) Department of Medical Physics, (2) Department of Emergency Medicine, Royal Perth Hospital, Perth, Western Australia; (3) Department of Pathology, University of Western Australia.
Referencias:
2. Boycott AE. The transition form life to death; the nature of filterable viruses. Proc. Royal Soc. Med. 1928;22:55-69.
3. Darlington C. The plasmagene theory of the origin of cancer. Br. J. Cancer 1948;2:118-126.
4. Papadopulos-Eleopulos E. A Mitotic Theory. J. Theor. Biol. 1982;96:741-758.
5. Papadopulos-Eleopulos E. Reappraisal of AIDS: Is the oxidation caused by the risk factors the primary cause? Med. Hypotheses 1988;25:151-162.
6. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM. Oxidative Stress, HIV and AIDS. Res. Immunol. 1992;143:145-148.
7. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papdimitriou JM. Is a Positive Western Blot Proof of HIV Infection? Bio/Technology 1993;11:696-707.
8. Beard JW, Sharp DG. Virus of avian erythromyeloblastic leukosis. Biochemia and Biophysica Acta 1954;14:12-17.
9. Gelderblom HR, Özel M, Hausmann EHS, Winkel T, et al. Fine Structure of Human Immunodeficiency Virus (HIV), Immunolocalization of Structural Proteins and Virus-Cell Relation. Micron Microscopica 1988;19:41-60.
10. Beard JW. Physical methods for the analysis of cells. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1957;69:530-544.
11. Bader JP. Reproduction of RNA Tumor Viruses. In: Fraenkel-Conrat H, Wagne RR, ed. Comprehensive Virology. New York: Plenum Press, 1975: 253-331. vol 4).
12. Toplin I. Tumor Virus Purification using Zonal Rotors. Spectra 1973: 225-235.
13. Temin HM, Baltimore D. RNA-Directed DNA Synthesis and RNA Tumor Viruses. Adv. Virol. Res. 1972;17:129-186.
14. Sinoussi F, Mendiola L, Chermann JC. Purification and partial differentiation of the particles of murine sarcoma virus (M. MSV) according to their sedimentation rates in sucrose density gradients. Spectra 1973;4:237-243.
15. Toyoshima K, Vogt PK. Enhancement and Inhibition of Avian Sarcoma Viruses by Polycations and Polyanions. Virol. 1969;38:414-426.
16. Aaronson SA, Todaro GJ, Scholnick EM. Induction of murine C-type viruses from clonal lines of virus-free BALB/3T3 cells. Science 1971;174:157-159.
17. Hirsch MS, Phillips SM, Solnik C. Activation of Leukemia Viruses by Graft-Versus-Host and Mixed Lymphocyte Reactions In Vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1972;69:1069-1072.
18. Barré-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F. Isolation of a T-Lymphotrophic Retrovirus from a patient at Risk for Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS). Science 1983;220:868-871.
19. Lee MH, Sano K, Morales FE, Imagawa DT. Sensitive reverse transcriptase assay to detect and quantitate human immunodeficiency virus. J. Clin. Microbiol. 1987;25:1717-21.
20. Brun-Vezinet F, Rouzioux C, Barre-Sinoussi F, Klatzmann D, et al. Detection of IgG antibodies to lymphadenopathy-associated virus in patients with AIDS or lymphadenopathy syndrome. Lancet 1984;i:1253-6.
21. Vilmer E, Rouzioux C, Vezinet Brun F, Fischer A, et al. Isolation of new lymphotropic retrovirus from two siblings with Haemophilia B, one with AIDS. Lancet 1984;i:753-757.
22. Rey MA, Spire B, Dormont D, Barre-Sinoussi F, et al. Characterization of the RNA dependent DNA polymerase of a new human T-lymphotropic retrovirus (lymphadenopathy associated virus). Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984;121:126-33.
23. Gallo RC, Wong-Staal F, Reitz M, Gallagher RE, et al. Some evidence for infectious type-C virus in humans. In: Balimore D, Huang AS, Fox CF, eds. Animal Virology. New York: Academic Press Inc., 1976: 385-405.
24. Varmus H. Reverse Transcription. Sci. Am. 1987;257:48-54.
25. Varmus H. Retroviruses. Science 1988;240:1427-1435.
26. Gallo RC, Sarin PS, Wu AM. On the nature of the Nucleic Acids and RNA Dependent DNA Polymerase from RNA Tumor Viruses and Human Cells. In: Silvestri LG, ed. Possible Episomes in Eukaryotes. Amsterdam: North-Holland Publishing Company, 1973: 13-34.
27. Tomley FM, Armstrong SJ, Mahy BWJ, Owen LN. Reverse transcriptase activity and particles of retroviral density in cultured canine lymphosarcoma supernatants. Br. J. Cancer 1983;47:277-284.
28. Temin HM. On the origin of RNA tumor viruses. Harvey Lect. 1974;69:173-197.
29. Gallagher RE, Gallo RC. Type C RNA Tumor Virus Isolated from Cultured Human Acute Myelogenous Leukemia Cells. Science 1975;187:350-353.
30. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM, Causer D. A critical analysis of the evidence for the isolation of HIV. At Website http://www.virusmyth.com/aids/data/epappraisal.htm 1997.
31. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM, Causer D. HIV antibodies: Further questions and a plea for clarification. Curr. Med. Res. Opin. 1997;13:627-634.
32. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM, Causer D. The Isolation of HIV: Has it really been achieved? Continuum 1996;4:1s-24s.
33. Lower R, Lower J, Kurth R. The viruses in all of us: Characteristics and biological significance of human endogenous retrovirus sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1996;93:5177-5184.
34. Marx JL. Human T-cell virus linked to AIDS. Science 1983;220:806-809.
35. Gougeon ML, Laurent-Crawford AG, Hovanessian AG, Montagnier L. Direct and indirect mechanisms mediating apoptosis during HIV infection: contribution to in vivo CD4 T cell depletion. Immunol. 1993;5:187-194.
36. Cohen J. Exploiting the HIV-chemokine nexus. Science 1997;276(5315):1261-1264.
37. Layne SP, Merges MJ, Dembo M, Spouge JL, et al. Factors underlying spontaneous inactivation and susceptibility to neutralization of human immunodeficiency virus. Virol. 1992;189:695-714.
38. Klatzmann D, Barré-Sinoussi F, Nugeyre MT. Selective Tropism of Lymphadenopathy Associated Virus (LAV) for Helper-Inducer T Lymphocytes. Science 1984;225:59-63.
39. Klatzmann D, Montagnier L. Approaches to AIDS therapy. Nature 1986;319:10-11.
40. Acres RB, Conlon PJ, Mochizuki DY, Gallis B. Rapid Phosphorylation and Modulation of the T4 Antigen on Cloned Helper T Cells Induced by Phorbol Myristate Acetate or Antigen. J. Biol. Chem. 1986;261:16210-16214.
41. Zagury D, Bernard J, Leonard R, Cheynier R, et al. Long-Term Cultures of HTLV-III-Infected T Cells: A Model of Cytopathology of T-Cell Depletion in AIDS. Science 1986;231:850-853.
42. Scharff O, Foder B, Thastrup O, Hofmann B, et al. Effect of thapsigargin on cytoplasmic Ca2+ and proliferation of human lymphocytes in relation to AIDS. Biochim. Biophysica. Acta. 1988;972:257-264.
43. Birch RE, Rosenthal AK, Polmar SH. Pharmacological modification of immunoregulatory T lymphocytes. II. Modulation of T lymphocyte cell surface characteristics. Clin. Exp. Immunol. 1982;48:231-238.
44. Zagury D, Bernard J, Leonard R, Cheynier R, et al. Long-Term Cultures of HTLV-III-Infected T Cells: A Model of Cytopathology of T-Cell Depletion in AIDS. Science 1986;231(21st February):850-853.
45. Laurent-Crawford AG, Krust B, Muller S, Rivière Y, et al. The Cytopathic Effect of HIV is Associated with Apoptosis. Virol. 1991;185:829-839.
46. Dourmashkin RR, O'Toole CM, Bucher D, Oxford JS. The presence of budding virus-like particles in human lymphoid cells used for HIV cultivation. VIIth International Conference on AIDS. Florence: 1991:122.
47. O'Hara CJ, Groopmen JE, Federman M. The Ultrastructural and Immunohistochemical Demonstration of Viral Particles in Lymph Nodes from Human Immunodeficiency Virus-Related Lymphadenopathy Syndromes. Human Pathology 1988;19:545-549.
48. Gallo RC, Sarin PS, Kramarsky B, Salahuddin Z, et al. First isolation of HTLV-III. Nature 1986;321:119.
49. Duesberg PH. Peter Duesberg responds. Continuum 1996;4:8-9.
50. Nermut MV, Steven AC, ed. Retroviridae. Animal Virus and Structure. Oxford: Elsevier, 1987
51. Gallo RC, Fauci AS. The human retroviruses. In: Isselbacher KJ, Braunwald E, Wilson JD, Martin JB, Fauci AS, Kasper DL, ed. Harrison's Principles of Internal Medicine. 13 ed. New York: McGraw-Hill Inc., 1994: 808-814.
52. Todaro GJ, Benveniste RE, Sherr CJ. Interspecies Transfer of RNA Tumour Virus Genes: Implications for the search for "Human" Type C Viruses. In: Baltimore D, Huang AS, Fox CS, ed. Animal Virology. New York: Academic Press Inc., 1976: 369-384.
53. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM, Causer D, et al. A critical analysis of the HIV-T4-cell-AIDS hypothesis. Genetica 1995;95:5-24.
54. Montagnier L. Lymphadenopathy-Associated Virus: From Molecular Biology to Pathogenicity. Ann. Int. Med. 1985;103:689-693.
55. Duesberg PD. Inventing the AIDS Virus.Washington, USA: Regnery Publishing, Inc., 1996.
56. Padian NS, Shiboski SC, Jewell NP. Female-to-male transmission of human immunodeficiency virus. JAMA 1991;266:1664-7.
57. Brettler DB, Forsberg AD, Levine PH, Andrews CA, et al. Human immunodeficiency virus isolation studies and antibody testing. Household contacts and sexual partners of persons with hemophilia. Arch. Int. Med. 1988;148:1299-301.
58. van der Ende ME, Rothbarth P, Stibbe J. Heterosexual transmission of HIV by haemophiliacs. Brit. Med. J. 1988;297:1102-3.
59. Padian NS, Shiboski SC, Glass SO, Vittinghoff E. Heterosexual transmission of human immunodeficiency virus (HIV) in northern California: results from a ten-year study. Am. J. Epidemiol. 1997;146:350-7.
60. Burger H, Weiser B, Robinson WS, Lifson J, et al. Transient antibody to lymphadenopathy-associated virus/human T-lymphotropic virus type III and T-lymphocyte abnormalities in the wife of a man who developed the acquired immunodeficiency syndrome. Ann. Int. Med. 1985;103:545-7.
61. Hockley DJ, Wood RD, Jacobs JP. Electron Microscopy of Human Immunodeficiency Virus. J. Gen. Virol. 1988;69:2455-2469.
62. Lecatsas G, Taylor MB. Pleomorphism in HTLV-III, the AIDS virus. S. Afr. Med. J. 1986;69:793-794.
63. Palmer E, Sporborg C, Harrison A, Martin ML, et al. Morphology and immunoelectron microscopy of AIDS virus. Arch. Virol. 1985;85:189-196.
64. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM. Virus Challenge. Continuum 1996;4:24-27.
65. Vartian JP, Meyerhans A, Henry M, Wain-Hobson W. High-resolution structure of an HIV-1 quasispecies: Identification of novel coding sequences. AIDS 1992;6:1095-1098.
66. Wain-Hobson S. Virological mayhem. Nature 1995;373:102.
67. Kozal MJ, Shah N, Shen N, Yang R, et al. Extensive polymorphisms observed in HIV-1 clade B protease gene using high-density oligonucleotide arrays. Nat. Med. 1996;2:753-759.
68. Wain-Hobson S, Sonigo P, Danos O, Cole S, et al. Nucleotide sequence of the AIDS virus, LAV. Cell 1985;40:9-17.
69. Lazo PA, Tsichlis PN. Biology and pathogenesis of retroviruses. Semin. Oncol. 1990;17:269-294.
70. Cunningham AL, Dwyer DE, Mills J, Montagnier L. Structure and function of HIV. Med. J. Aust. 1996;164:161-173.
71. Barré-Sinoussi F. HIV as the cause of AIDS. Lancet 1996;348:31-35.
72. Lauritsen JL. NIDA meeting calls for research into the poppers-Kaposi's sarcoma connection. In: Duesberg PH, ed. AIDS: Virus- or Drug Induced. London: Kluwer Academic Publishers, 1995: 325-330.
73. Ho DD, Neumann AU, Perelson AS, Chen W, et al. Rapid turnover of plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1 infection. Nature 1995;373:123-126.
74. Holodniy M, Mole L, Winters M, Merigan TC. Diurnal and short-term stability of HIV virus load as measured by gene amplification. J. Acquir. Immun. Defic. Syndr. 1994;7: 363-8.
75. O. Brien W, Hartigan PM, Martin D, Esinhart J, et al. Changes in plasma HIV-1 RNA and CD4+ lymphocyte counts and the risk of progression to AIDS. Veterans Affairs Cooperative Study Group on AIDS. NEJM 1996;334: 426-31.
76. Schapiro JM, Winters MA, Stewart F, Efron B, et al. The effect of high-dose saquinavir on viral load and CD4+ T-cell counts in HIV-infected patients. Ann. Int. Med. 1996;124:1039-50.
77. Francis DP. The search for the cause. In: Cahill KM, ed. The AIDS epidemic. 1st ed. Melbourne: Hutchinson Publishing Group, 1983: 137-150.
78. Guilbert B, Fellous M, Avrameas S. HLA-DR-specific monoclonal antibodies cross-react with several self and nonself non-MHC molecules. Immunogenetics 1986;24:118-121.
79. Gonzalez-Quintial R, Baccala R, Alzari PM, Nahmias C, et al. Poly(Glu60Ala30Tyr10) (GAT)-induced IgG monclonal antibodies cross-react with various self and non-self antigens through the complentarity determining regions. Comparison with IgM monoclonal polyreactive natural antibodies. Euro. J. Immunol. 1990;20:2383-2387.
80. Berzofsky JA, Berkower IJ, Epstein SL. Antigen-Antibody Interactions and Monoclonal Antibodies. In: Paul WE, ed. Fundamental Immunology. 3rd ed. New York: Raven, 1993: 421-465.
81. Fauci AS, Lane HC. Human Immunodeficiency Virus (HIV) Disease: AIDS and Related Disorders. In: Isselbacher KJ, Braunwald E, Wilson JD, Martin JB, Fauci AS, Kasper DL, ed. Harrison's Principles of Internal Medicine. 13th ed. New York: McGraw-Hill Inc., 1994: 1566-1618.
82. Owen M, Steward M. Antigen recognition. In: Roitt I, Brostoff J, Male D, ed. Immunology. 4th ed. London: Mosby, 1996: 7.1-7.12.
83. Ternynck T, Avrameas S. Murine natural monoclonal antibodies: a study of their polyspecificities and their affinities. Immunological Reviews 1986;94:99-112.
84. Pontes de Carvalho LC. The faitfullness of the immunoglobulin molecule: can monoclonal antibodies ever be monospecific. Immunol. Today 1986;7:33.
85. Chassagne J, Verelle P, Fonck Y, Legros M, et al. Detection of lymphadenopathy-associated virus p18 in cells of patients with lymphoid diseases using a monclonal antibody. Ann. Institut. Past./Immunol. 1986;137D:403-408.
86. Parravicini CL, Klatzmann D, Jaffray P, Costanzi G, et al. Monoclonal antibodies to the human immunodeficiency virus p18 protein cross-react with normal human tissues. AIDS 1988;2:171-177.
87. Guilbert B, Mahana W, Gilbert M, Mazie JC, et al. Presence of natural autoantibodies in hyperimmunized mice. Immunol. 1985;56:401-8.
88. Matsiota P, Chamaret S, Montagnier L. Detection of Natural Autoantibodies in the serum of Anti-HIV Positive-Individuals. Ann. Institut. Past./Immunol. 1987;138:223-233.
89. Bess JW, Gorelick RJ, Bosche WJ, Henderson LE, et al. Microvesicles are a source of contaminating cellular proteins found in purified HIV-1 preparations. Virol. 1997;230:134-144.
90. Arthur LO, Bess JW, Jr., Urban RG, Strominger JL, et al. Macaques immunized with HLA-DR are protected from challenge with simian immunodeficiency virus. J. Virol. 1995;69:3117-24.
91. Sasaki H, Nakamura M, Ohno T, Matsuda Y, et al. Myosin-actin interaction plays an important role in human immunodeficiency virus type 1 release from target cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1995;92:2026-2030.
92. Pearce-Pratt R, Malamud D, Phillips DM. Role of cytoskeleton in cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus. J. Virol. 1994;68:2898-2905.
93. Choudhury S, El-Farrash MA, Kuroda MJ, Harada S. Retention of HIV-1 inside infected MOLT-4 cells in association with adhesion-induced cytoskeleton reorganisation. AIDS 1996;10:363-368.
94. Arthur LO, Bess JW, Sowder II RC, Beneviste RE, et al. Cellular proteins bound to immunodeficiency viruses:implications for pathogenesis and vaccines. Science 1992;258:1935-1938.
95. Chamaret S, Squinazi F, Courtois Y, Montagnier L. Presence of anti-HIV antibodies in used syringes left out in public places, beaches or collected through exchange programs. XIth International Conference on AIDS. Vancouver:1996.
96. Modrow S, Hahn B, Shaw GM, Gallo RC, et al. Computer-assisted analysis of envelope protein sequences of seven human immunodeficiency virus isolates: prediction of antigenic epitopes in conserved and variable regions. J. Virol. 1987;61:570-578.
97. Frank H. Oncovirinae: Type C Oncoviruses. In: Nermut MV, Steven AC, ed. Animal Virus and Structure. Oxford: Elsevier, 1987: 273-287.
